第二章 蛋白质样品的制备.pptxVIP

第二章 蛋白质样品的制备; 蛋白质样品的制备是蛋白质组研究的第一步，无论后续采用怎样的分离或鉴定手段，样品制备都是关键步骤。从蛋白质组大规模研究的角度而言，要求样品制备尽可能获得所有的蛋白质，但是由于蛋白质种类多、丰度不一和物化特性多样等，要达到真正的全息制备是具有难度的。;“在制备中丢失的蛋白是永远不可能在后面的 试验中弥补回来的” ;样品制备的原则;一、样品的类型 1.整体样品 是生物个体小的物种（如微生物），可以整体 取样。 2.组织样品 有一个采样的过程，就是从整体部分或整批器官 中抽取一定量具有代表性的样品进行实验。 3.细胞样品 包括固体基质中培养的细胞、体外悬浮培养生长 的细胞、周期性细胞样品（如红细胞、淋巴细 胞）和从组织中分离同类的细胞样品。 4.可溶性样品 是可溶性液体样品，如血清、血浆、尿样、脑 脊液以及细胞和组织的水溶性提取物。 ;二、组织及细胞破碎 为了完全分析所有的细胞内蛋白，组织与细胞必须进 行有效的破碎。破碎方法的选择依赖于样品来源（如细 胞、固体组织或者其它的生物材料），同时也依赖于这种 分析是获得所有的蛋白质还是特殊的亚细胞器组分。 蛋白酶在细胞破碎时很可能释放出来，其会导致某些 蛋白质降解而使双向电泳图谱的分析复杂化，因此蛋白质 样品应该利用蛋白酶抑制剂加以保护。 ;（一）温和的裂解方法 通常应用于组分比较简单的样品，例如组织 培养的细胞、血细胞和一些微生物，或者用于分 析某一特定的细胞器，例如只需要裂解胞质蛋白、 完整的线粒体或其它的细胞器。有时这些技术联合 起来应用。 ;1. 渗透裂解 非常温和的裂解方法，可进一步进行亚细胞分级 应用对象： 血细胞、组织培养细胞。 操作步骤： 将细胞悬浮于渗透胞溶液中，细胞溶 胀而释放出细胞内容物。 ;2. 冻融裂解 许多类型的细胞可以通过快速反复冻融得到裂解 应用对象：细菌细胞、组织培养细胞。 操作步骤：使用液氮，快速反复冻融至符合实验要 求为止。 ;3. 裂解液裂解 含有去污剂的裂解液处理细胞、组织以裂解细胞 膜，使细胞内容物释放出来。 应用对象：组织培养细胞 操作步骤：将细胞直接置裂解液或样品液中，进行 悬浮处理。;4.酶裂解 有细胞壁的细胞可以通过酶解去除细胞壁得以温 和裂解。 应用对象：植物细胞、细菌细胞、真菌细胞。 操作步骤：将细胞悬浮于专一性酶的等渗溶液中。 ;;1. 超声裂解法 超声仪可以产生超声波，通过切应力来裂解细 胞。在剧烈搅拌的状态下会产生剪切效果。 应用对象：悬浮细胞 操作步骤：要进行间歇处理，减轻产生热和泡沫， 样品处理应在冰浴中进行。;;3.研磨法 用研钵或研杵研磨细胞 应用对象：固体组织细胞、微生物细胞。 操作步骤：组织或细胞通常冻存于液氮中，随后研 磨成粉状，加氧化铝或砂有助于研磨。;;;;⑴ PMSF(苯甲基磺酰氟） 是一种不可逆抑制剂，通常浓度为1mmol/L,灭活丝氨酸蛋白酶和一些半胱氨酸蛋白酶，但是其局限在于在水溶液中迅速失活，因此，现用现加效果较好；另外，在二硫苏糖醇（DTT）或者β-巯基乙醇溶液中PMSF的抑制效果可能会减小，因此在含巯基的试剂中可在晚些时候加入。 ⑵ AEBSF 为不可逆抑制剂，通常工作浓度为4mmol/L，作用及PMSF相似，但溶解性较好，且毒性低。但 是AEBSF可能会改变蛋白的等电点。;⑶ 金属蛋白酶抑制剂乙二胺四乙（EDTA） 乙二醇双四乙酸（EGTA） 通常应用1mmol/L的工作浓度，通过螯合自由的金属离子来抑制金属蛋白酶活性。 ⑷ 肽蛋白酶抑制剂 亮抑酶肽（leupetin），它是可逆性蛋白酶抑制剂，在含DTT的溶液中以低浓度的形式保持活性，抑制一些丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶的活性；胃蛋白酶抑制剂A（pepstatin A），抑制天冬氨酸蛋白酶的活性；抑蛋白酶肽（aprotinin），抑制许多丝氨酸蛋白酶；苯丁抑制素(bestatin),抑制氨基蛋白酶。但是，这些蛋白酶抑制剂价格昂