Establishment of serum-free and feeder free culture system for human embryonic stem cells人胚胎干细胞无血清无饲养层培养体系的建立.pdfVIP

摘 要 目的： 拟建立一种人胚胎干细胞无饲养层无血清的培养体系，使其能维持人胚胎 干细胞未分化的增殖状态及全能性，为人胚胎干细胞进一步的基础研究及将来 的临床应用提供有益的探索。 方法： 在小鼠胚胎成纤维细胞和常用的Knockout培养基共同支持下，扩增人胚胎 干细胞X-01 ，Ⅳ型胶原酶消化传代培养。基质胶铺底后，将人胚胎干细胞分别 置于常用的Knockout培养基（1组）、自制无血清培养基（2组）和添加bFGF及肝 素的改良无血清培养基（3组）中进行培养。连续培养10代后观察比较三组培养 条件下人胚胎干细胞形态学变化、克隆数目及大小情况。同时借助细胞免疫荧 光染色、流式细胞术和体外拟胚体形成等方法检测人胚胎干细胞的未分化状态 和全能性。 结果： 1、细胞形态学显示：常用Knockout 培养组（第 1 组）条件下，hESCs X-01 细胞具有典型的人胚胎干细胞特征形态，克隆大，饱满，形似鸟巢，细胞间紧 密堆积，细胞核大，胞核与胞浆的比例高；自制无血清培养组（第 2 组）：hESCs X-01 克隆呈扁平椭圆形，体积稍小，欠饱满，细胞间较松散，传代 3 次后逐渐 呈分化状，不能连续传代；改良无血清无饲养层培养组（第 3 组）：克隆形态与 第 1 组相似，克隆大，饱满，克隆内细胞排列紧密，核大，核质比高。 2 、单位视野下hESCs X-01 细胞克隆个数及大小的比较结果显示：常用 Knockout培养组（第1组）hESCs X-01细胞单位视野内克隆个数为（5.9 ±1.0）个， 自制无血清培养组（第2组）为（5.0 ±0.8 ）个，改良无血清培养组（第3组）为 （6.6 ±0.7 ）个，第1组与第3组间克隆个数无差异（P ＞0.05 ），而第2组克隆个数 明显少于第1组和第3组（P ＜0.05 ）。第1组hESCs X-01细胞单位视野中克隆大小 占整个视野面积的百分比为(51.0 ±7.6)%，第2组为 （41.9 ±7.6 ）%，第3组为 （55.6 ±7.9 ）%，同样第1组与第3组间克隆体积大小无明显差异（P ＞0.05 ），而第2组 克隆体积显著小于第1组和第3组（P ＜0.05 ）。 II 3、免疫荧光染色结果示：hESCs均表达特异性多潜能标志物Nanog 、Oct-4、 Tra-1-60和SSEA-4等，而不表达SSEA-1。本研究显示常用Knockout培养组（第1 组）和改良无血清培养组（第3组）hESCs X-01细胞均表达上述特异性多潜能标 志物（Nanog 、Oct-4、Tra-1-60和SSEA-4），而不表达SSEA-1；而自制无血清培 养组（第2组）中上述指标均弱阳性或阴性。 4 、三组培养条件下分别行流式细胞术检测，结果显示常用Knockout培养组 （第1组）和改良无血清培养组（第3组）hESCs X-01细胞高表达特异性表面标 志物SSEA-4 （表达率分别为84.53%、86.73% ），低表达SSEA-1 （表达率分别为 6.84%、7.34% ）；而自制无血清培养组（第2组）hESCs X-01细胞较低表达特异 性表面标志物SSEA-4 （表达率为55.82% ），较高表达SSEA-1 （表达率为39.43% ）。 5、拟胚体形成实验结果显示：常用Knockout培养组（第1组）和改良无血 清培养组（第3组）条件下培养的hESCs X-01细胞，在MEF培养基中悬浮培养， 7d后能体外分化形成囊状拟胚体，而自制无血清培养组（第2组）hESCs X-01细 胞逐渐呈分化状，不能持续传代，不能形成拟胚体。 结论： 本研究通过添加bFGF 和肝素来改良本实验室已获得国家专利的无血清培 养基，初步建立了一种人胚胎干细胞无血清无饲养层培养体系，能维持人胚胎 干细胞未分化增殖状态及全能性，与常用无血清培养体系相比，其培养效果无 明显差异，但在便宜的价格、明确的成分、无动物源性污染等方面有很好的优 势。 关键词：人胚胎干细胞；自制无血清；无饲养层；bFGF ；肝素 III