双抗夹心ELISA法测定水资源、食品及饲料中总甾体激素含量.pdfVIP

第27卷第12期 应用化学 V01．27No．12 CHINESE Dec．2010 2010年12月 JOURNALOFAPPI。lEDCHEMISTRY 双抗夹心ELISA法测定水资源、食品及 饲料中总甾体激素含量 马德章8 刁昱文6 杨佳新8 王宝德‘ 于源华” (“长春理工大学生命科学技术学院长春130022； 6吉林大学畜牧兽医学院 长春；‘中国石油管道长吉分公司 长春) 摘要基于睾丸酮丛毛单胞菌(C．test)具有降解甾体类物质的特性，其细胞中3“一羟肇类同醇脱氧酶／碳酰 基还原酶(3a—HSD)是诱导酶，建立了以3理一HSD的测定总甾体激素含量的双抗火心酶联免疫反应(E1。ISA) 方法。实验结果表明，睾丸酮类甾体激素的量在0．5～600“g／g之间，与30r—HSD酶表达量具有明显线性关 系。应用这种方法对多种水资源、饲料、肉食品进行了榆测二检测结果表明，松花湖水中的睾丸酮类甾体激素 含量为34．5斗g／g，明显高于其它水系；被测饲料中睾丸酮类甾体激索含量均大丁2o-g／g；肉类样品的检测结 果均低于检测下限。本方法与高效液相色谱法的测定结果相符： 关键词 甾体激素，酶联免疫反应，3a-羟基类|匍醇脱氢酶／碳酰基还原酶 中图分类号：0652 文献标识码：A 文章编哆：1000-0518(2010)12—14664)4 DOI：10．3724／SP．J．1095．2010．00067 随着工农业的发展，环境污染口益严重，对全球生态及人类健康已造成严重威胁。由于甾体激素不 易生物降解，在极低的浓度条件下就会显示出较强的下扰内分泌作用。人体摄入甾醇类物质过多，可造 成代谢失调，引起高血脂、高胆固醇、高血压、冠心病、脑中风等，H具有较强致癌性…。许多发达困家和 地区均已经在这方面展开分析调查工作旧l，而国内则鲜有报道。目前，已有检测方法种类较多皿一。，包括 化学分析方法、生物学方法、细胞学方法等，各国均以液相色谱和气相色谱的化学分析方法为主o¨。 睾丸酮丛毛单胞菌(C．test)具有降解甾醇类化合物的特性，且细胞中关键酶3a．羟基类固醇脱氢 酶／碳酰基还原酶(3a．HSD)的表达与环境巾该化合物的含量成正相关州J。目前，国内外对于此菌的研 究主要集中在细胞内功能酶基因的定位、降解机理及工程菌的表达等方面。9’。本文建征了基于3a．HSD 的甾醇类化合物的双抗体夹心ELISA检测方法。并与HPLC方法进行了比较分析，结果表明，2种方法 检测效果相符，但ELISA检测方法快速、便携、特异性强，而且能检测样品中甾醇类化合物总量，冈此使 用价值大。 1实验部分 1．1仪器、试剂和材料 冷冻离心机(日本日立)；U-2800型紫外分光光度计(H本日立)。 保存，其中单抗效价为1：10 1。 2010-01-26收稿，2010-05—10修网 占林省科技厅蕾大项目资助 通讯联系人：于源华，教授；E-mail：yu)ruanhua8888@126“㈣；研究力向：‘ii物j，断髓测 第12期 马德章等：双抗夹心ELISA法测定水资源、食品及饲料中总甾体激素含量 检测水样均为现场取样后4℃保存，饲料及肉类样品为市场购买。 1．2实验方法 1．2．1 双抗体夹心ELISA方法的建立鼠抗3 IgG)浓度是1：5000。用稀释液将纯的3a—HSD／CR蛋白(10 6．25斗g／L作为抗原，进行测定，绘制3d—HSD／CR标准曲线。 mL 将睾丸酮配制成50mmol／L甲醇溶液作为诱导剂，加入至5LB培养基中，使其终浓度分别为 600、300、150、75、37．5、18．75、9．38、4．69、2．34、1．17、0．59、0．29mg／L，接种C．test菌，27℃培养12h。