豚鼠气单胞菌CB101中几丁质酶基因的克隆及其异源表达的全酶蛋白和酶片段的功能研究.pdfVIP

M92s04， 冰浴轻晃10min； (7)4℃下8000rpm离心20min，上清即周间质总蛋白； (8)用适当缓冲液透析，冻干，再用4—6mLbu腩rA重溶； (9)加lmL (10)将混合物上柱，装柱前柱底用底帽封上： (11)去帽盖，逐管收集流出液； (12)用bu仃crB清洗2次，每次2mL： 蛋白所在，4℃保存。 3结果与讨论 3．1结果 3．1．1几丁质降解菌cBlOl的分离与鉴定 从厦门近海海域采集得到的6份不同泥样和水样中，分离到十几株具有较高几丁 质酶活性的细菌和放线菌。将这些初筛获得的菌株接种到以胶体几丁质为唯一碳源和 具有较高的潜在工业应用价值。经鉴定该菌株为豚鼠气单胞菌(爿鲫珊Dn甜∞vme)。 3．1．2豚鼠气单胞菌cBl01产酶的初步分析 分别接种等量cBl01于四种不同培养基(口为生长培养基、一为生长培养基加l ％葡萄糖、▲为生长培养基加1％晶体几丁质、△为生长培养基加l％胶体几丁质) 中摇瓶培养，选取不同时段检测培养液上清中几丁质酶总活力，结果(图1)显示cBlol 在无几丁质的诱导下能组成型分泌少量几丁质酶。添加胶体几丁质诱导物后的表达量 大幅增加，添加葡萄糖则抑制其表达，添加晶体几丁质所产生的增效不明显。 襄 o o O 4．5 8．5 13．5 30 岫鲋n 图1豚鼠气单胞菌cBlOl总儿JJ质酶的诱导表达 16 淀总囊自恁，进行SDS—PAGE分孝厅。蛋是凝胶复性震豹薅功能染色爨示在总蛋白中 有四条几丁质酶活性带，分别约为85kD、66kD、60kD和50kD(图2)。 ～些几丁质酶和几丁结合蛋自能与几丁质特异结合，因而可用几丁质往进行初步 筑亿与富校。将程簿液上粉状晶体几了质柱，先露lMNael洗去与尼丁质≈}特异畿结 合麴蛋白，髯让O～3M盐酸瓤梯度浚聪出特异魏结合蛋囱劳透援。收集到的蛋自再 作SDs．PAGE分析，发现存在有7种几丁质特异缝螽蛋囱，活性浓戗表明其中4个 是几丁质酶，与前述发酵培养液中几了质酶的检测镭粱一致，舅3个蛋白分子璧分粥 为70kD、30kD和25kD(图3)， 可熊慧没有凡丁质酶活往的几丁缩合骚自。 圈2脬鼠气单飘镯CBl01发酵 图3璐鼠气单腿麓CBl01分泌 培养液中几丁质酶的检测 的几丁质酶及几丁结合蛋白 3．1．3凡丁质酶chi重的克隆及c觚lBNA序列 根据澄稚名gmmDH甜藩凡丁麓酶蓬因的僳守滓弼，设计了一对P深S}兹(鲡方 (1)在皿克隆和测序前确证它是否就是所要的目的纂因，以免可能造成时间和测序 爨金静滚费；(2)由予后续所选用的表达簸体是爝来快速统佑蠢的蛋白静，需簧在c 端融念表达6今至薹is橼记tag)，这撵在～定程度上磁能影嚷黪数辑爨，所以移望可 以表达一个无融合蛋囱的酶，同含有6个Histag的酶进行比较，以确定引入6个His ta《 是否真有干扰作用。 溺4献A．eavi∞总DNA串扩增出静 豹2．6kbPcR产物 1．单酶切后的pUC(2．69kb) 2．分子薰标记 3．PCR产物 黪，提出质粒，单双酶切验证了它已插入了目的片段(图6和7)。 7 田5重组质牲pBl∞-d虹l和pl罐枷l的构t噩噩克●、■序(利用尹Bh—霄鞋的■序引糖13、T7)的流程翟 甩劬I、肼f宪全●切PBh¨Kl■6】，峰、，07碲，，l●如受充■片爱和的2嘶】埽盼奠砷．序列．由于6l，崎、