转录辅助因子PC4（positive coactivator 4）的转基因构建及斑马鱼转基因技术平台的建立.pdfVIP

摘要 摘 要 鱼类因其产卵量大、体外受精、体外发育、胚胎操作简便和易于观察等特 点，被选为转基因研究的理想材料。斑马鱼因其个体小、生长速度快、养殖成 本低、生命力强和适宜实验室大规模饲养等诸多优点，成为鱼类转基因研究的 首选研究对象。斑马鱼被广泛应用于脊椎动物胚胎发育、功能基因组以及人类 遗传疾病等方面的研究。 Coactivator 我们实验室的前期研究表明，转录辅助因子PC4(Positive4)在 脊椎动物早期发育过程中可能扮演着重要的角色。在本实验中，我们首先把野 微注射法和精子介导法将PC4基因转入斑马鱼和团头鲂中，但均未获得转基因 个体。显微注射没有成功可能的原因是pAAV．IRES．hrGFP载体基因转移的效率 不高；而精子介导法没有得到转基因鱼，除了载体的原因外，我们选用的对精 子电击的电压可能不适合团头鲂。 50G作为转基因的载体，希望首先完善转基因 因此，我们改用pT2AL200R1 的方法。根据其他实验室的经验，pT2AL200R150G载体能够很容易地穿过卵黄 膜，因此直接将外源基因注射到卵黄中也能够获得很好的转基因效果。 起被注射到受精卵内时可以增加外源基因插入细胞基因组的机会。此外， 外转录而来的转座酶mRNA一起注射到斑马鱼受精卵中，在注射的127个斑马 鱼受精卵中，我们获得了31个EGFP阳性的斑马鱼胚胎。但当这些EGFP阳性 的斑马鱼胚胎发育成为幼鱼时，仅有一部分可以检测到EGFP的表达(在观察的 8条幼鱼中，仅有3条可以观察到EGFP的表达)。这表明在这些EGFP阳性的 斑马鱼胚胎中，外源基因大部分并不是稳定整合的。 下面打算通过显微注射来获得表达野生型PC4基因或突变型PC4基因的转基因 斑马鱼，来初步检测PC4对脊椎动物早期发育的影响。我们也期望用 摘要 系统的诸多优点可能使得外源基因成功整合更容易。此外，在我们利用 pAAV—IRES-hrGFP载体进行精子介导法转基因时已经积累了一些经验。比方说， 在我们精子介导法转基因的预备实验中，获得了上千条鱼苗，这表明我们在体 外授精、精子预处理和鱼苗孵化等方面是成功的。我们期望对精子介导法转基 因的条件进行改进，以建立精子介导的转基因技术平台。 关键词：斑马鱼；转基因；PC4；显微注射；精子介导的转基因(SMGT) II Abstract ABSTRACT tobe for transfer for Fishareexcellentanimal used technology system gene severalreasons．Thesenumberof fromone include large embryosproduced mating， fertilizationin of in and of vitro，developembryosvitro，easyscreeningmanipulation undera toseveral developingembryos dissectingmicroscope．Dueuniquegenetic in as featuresinherent small zabrafish，suchsize，short maintenance，