SCI论文写作——基础研究细胞类.PPT

图片包含信息：组别，每一个条带显示的是什么蛋白，处理（处理剂，处理时间/浓度），图片去色 RNA提取 甲醛变性电泳 印迹转移 预杂交 杂交（变性探针） 洗膜 放射自显影或化学发光 RNase protection assay (RPA) Sensitive and quantitative alternative to Northern blots for the measurement of gene expression levels. Labelled antisense cRNA is transcribed from a DNA clone in an appropriate vector, hybridized with an mRNA sample, and single stranded RNA digested away with RNase, then run out on a gel. The amount of labelled RNA surviving is directly proportional to the amount of target mRNA present in the sample. 萤火虫荧光素酶(firefly luciferase) (Luc) 荧光素酶可以催化荧光素luciferin氧化成oxyluciferin，在luciferin氧化的过程中，会发出生物荧光。然后通过荧光测定仪(luminometer)或液闪测定仪就可以测定luciferin氧化过程中释放的生物荧光。通过荧光素和荧光素酶这一生物发光体系，可以极其灵敏、高效地检测基因的表达。通常把感兴趣的基因转录的调控元件克隆在luciferase的上游或其他适当的地方，构建报告基因质粒。然后转染细胞，适当刺激或处理后裂解细胞，测定荧光素酶活性。通过荧光素酶活性的高低判断刺激前后或不同刺激对感兴趣的调控元件的影响。 2.蛋白质与蛋白质相互作用研究技术 Co-IP（免疫共沉淀） with antibody against one protein followed by Western blot with antibody against another protein 直接或间接相互作用 GST pull-down assay 直接相互作用 Yeast two-hybrid assay 酵母双杂交实验 FRET (fluorescence resonance energy transfer) assay 荧光能量共振转移实验 免疫共沉淀（Co-IP） * SCI 论文网 GST pull-down assay SCI 论文网 Yeast two-hybrid assay SCI 论文网 3. 磷酸化蛋白质研究方法 Western blot with phospho-specific antibodies. Phosphopeptide and phosphoamino acid analysis by mass spectrophotometric analysis. 激酶活性的测定 　　信号转导过程中往往涉及多种激酶的活化，因而对这些激酶活性的测定在信号转导研究中具有重要意义。常见激酶活性的测定有PTK、PKC及PI-3K等。均有商品化的试剂盒。 SCI 论文网 体外激酶实验 SCI 论文网 IC-MS 质谱鉴定磷酸化蛋白的全过程是: (1)样品处理; (2)磷酸化肽的识别; (3)磷酸化位点的确定; (4)磷酸化蛋白定量 SCI 论文网 4. 基因转录活性检测 信号蛋白转录水平表达（mRNA）的检测: RT- PCR / Realtime RT- PCR Northern blot analysis. “gene chip” to measure changes in gene expression at larger scales. 基因启动子/增强子转录活性的检测: Transient or stable reporter assay—luciferase (Luc) . SCI 论文网 实时荧光定量PCR （Quantitative Real-time PCR） * qRT-PCR是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。 图注要包含所检测的因子，细胞系名称及处理方法，结果的数据统计方法及显著性差异的标示。 SCI 论文网 双荧光素酶报告基因