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FastKing一步法反转录-荧光定 量试剂盒(Probe) (FP314) 操作指南 天根生化科技（北京）有限公司 版本号 实验准备 1. RNA样本 2. 移液器及配套枪头（RNase-free ） 3. 1.5 ml 离心管（RNase-free ），200 μl PCR管（RNase-free ） 4. 涡旋振荡器，台式离心机，金属浴/ PCR仪 Step 1 融解2 ×FastKing One Step Probe RT-qPCR MasterMix ，50 ×ROX Reference Dye，RNA模板， 引物，探针和RNase-Free ddH O，并将所有试剂在室温下平衡并彻底混匀，之后置于冰上。 2 使用前将每种溶液涡旋振荡混匀，简短离心以收集残留在管壁的液体。 Step 2 建议在冰上按下表进行Real Time PCR反应液的配制 组成成分 50 μl 体系 2 ×FastKing One Step Probe RT- 25 µl qPCR MasterMix 25 ×FastKing Enzyme Mix 2 µl 上游特异性引物(10 µM) 1.25 µl 下游特异性引物(10 µM) 1.25 µl 探针(10 µM) 1.0 µl RNA模板 10 pg-1 µg total RNA 50 ×ROX Reference Dye 跟据不同仪器添加 RNase-Free ddH O 补水至50 µl 2 Tips 1. 配制体系时，应首先确定所需的反应数量，然后在反应数量的基础上增加10%-20% ，计算体系配制数 量。例如，一共需要做5个定量反应时，则体系配制数量至少为6 ；一共需要做10个定量反应时，则体 系配制数量至少为11；一共需要做20个定量反应时，体系配制数量至少为22 。以此类推。 2. 按配制数量，先计算除RNA模板和水之外的组分所需的用量，在冰上将所有组分共同配制到同一管中 制成混合物，彻底混匀，短暂离心。 3. 计算每个样本所需加入的RNA模板的体积和所需补充的ddH O的体积。如果每个样本所需的ddH O体 2 2 积都相同，可计算总体所需的ddH O体积并加入到混合物中，彻底混匀。 2 1个50 μl体系 6个50 μl体系 11个50 μl体系 22个50 μl体系 试剂 使用量 使用量 使用量