基因操作的基本技术Ⅳ－探针制备与标记技术.DOC

第六章 探针制备与标记技术 实验一 核酸探针的制备 一、原理和用途 核酸探针制备的方法很多，经典的方法包括以重组单链噬菌体为模板的单链DNA探针的合成，利用体外转录原理进行的单链RNA探针的合成，以mRNA为模板进行的cDNA探针的合成，以及寡核苷酸的人工合成；目前更为常用且简便的是双链DNA探针的制备，其来源包括纯化的限制性酶切片段或PCR产物。本实验以M13噬菌体为模板，学习单链DNA探针合成的基本操作。 单链DNA探针合成的基本原理是将人工合成的寡核苷酸与重组M13噬菌体中的单链DNA退火结合，利用大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段（简称Klenow酶）对退火引物的延伸作用，催化与模板链互补的标记探针的合成。由于反应产物长度及放射性标记dNTP结合量的均一性不高，通常需要对反应产物进行限制酶切和琼脂糖凝胶电泳分离，以便获得长度一致的双链DNA探针。 单链DNA探针特别适合用S1核酸酶或绿豆核酸酶进行的mRNA 51端结构分析，真核基因外显子位置的确定，以液体杂交进行的mRNA定量，无载体序列探针的制备，以及基因或cDNA特定区域的显示等。由于M13噬菌体载体的多克隆部位上游多有lac基因或T7等启动子序列，根据这些序列合成的寡核苷酸可以作为通用引物，用于任何与噬菌体插入片段互补的单链DNA探针的制备。 二、实验材料 单链M13噬菌体DNA。 三、溶液与缓冲液 1．1