Separation and purification of Bighead GABA receptor鳙鱼GABA受体的分离与纯化.pdfVIP

论文题目：鳙鱼 GABA 受体的分离与纯化 学科专业：高分子化学与物理 学位申请人：顾玲 指导教师：任天瑞 中文摘要 中文摘要 中文摘要中文摘要 γ-氨基丁酸（GABA ）是脊椎动物和无脊椎动物中枢神经系统内重要的抑制 性递质，其传递作用由 GABA 受体介导，该受体是各种有机氯类以及氟虫腈、阿 维菌素类杀虫剂的作用靶标，还与人的许多神经性疾病密切相关。据文献报道氟 虫腈等杀虫剂对哺乳动物安全无毒，但在具有高效杀虫活性的同时，对鱼类、蜜 蜂等却具有高毒性，说明鱼类 GABA 受体与哺乳动物存在差异。本文通过分离纯 化鱼类的 GABA 受体，比较了鱼类和哺乳动物两类脊椎动物 GABA 受体的异同点， 这对于筛选高选择性的环境友好型新农药具有相当重要的作用。本文的研究成果 如下： 第一，本文首次选用我国四大家鱼中养殖规模最大的鳙鱼作为研究对象，比 较六种去污剂溶出的 GABA 受体蛋白浓度，发现 1% （V/V ）Nonidet P-40 溶出的 蛋白量最多，达到 729.01 μg/mL 。 第二，以环氧基修饰的琼脂糖(Sepharose 6B)为基质，偶联经典苯二氮卓类 配体 Ro7-1986/1，制备了亲和层析介质；并通过硫代硫酸钠滴定法测得琼脂糖上 环氧基修饰密度达到 66.8 μmol/g 胶 ，配体 Ro7-1986/1 的偶联密度为 63.12 μ mol/g 胶。 第三，利用制备的亲和柱，结合超滤法，聚乙二醇透析法以及 DEAE-sephacel 离子交换层析法纯化得到鳙鱼脑中的 GABA 受体。得到的 GABA 受体由 SDS 之后得到两条清晰的条带，经 Gel-Pro-Analyze 分析软件分析其分子量分别为 46 KDa 和 42 KDa ，可能分别为鳙鱼 GABA 受体的α和β亚基，与哺乳动物 50 KDa 左右的 GABA 受体亚基相差不大。并且，我们通过 Bradford 法测定纯化后受体的 浓度为 4.6 μg/mL 。 第四，通过异硫氰酸荧光素（FITC）修饰GABA 得到荧光配体（FITC-GABA）。 测得的 FITC-GABA 与鳙鱼 GABA 受体粗提物的解离常数（Kd）和最大结合容量 （Bmax）与哺乳动物相比均较高，分别为88.89 nM，1.81 pM/mg 蛋白，说明鱼 类 GABA 受体结合 GABA 的量更多，但是结合稳定性较低。FITC-GABA 与纯化后 受体的解离常数（Kd）和最大结合容量（Bmax）分别为 13.84 nM，824.5 pM/mg 蛋白。其中，纯化后受体的最大结合容量是粗提物的 455 倍，证明本实验使用的 一系列纯化方法对于分离鳙鱼 GABA 受体是有效的。研究鳙鱼 GABA 受体与 GABA 以及其他药物之间的相互作用对于开发新型高效的农药具有重要意义。 关键词：关键词：鳙鱼;GABA 受体;纯化;亲和实验 关键词关键词：： Abstract γ-amino butyric acid (GABA) is the major inhibitory neurotransmitter in the central nervous system of vertebrates and inverteb ates, whose transmission effect is mediated by the GABA receptor. The receptor is the target of various organochlorine insecticides and fipronilave