原生质毯湾制备和转化.pptVIP

文献汇报 2011.3.3 Click to edit company slogan . Company Logo L o g o * L o g o 双层or单层培养基 擦镜纸收集菌丝体or离心收集菌丝体 酶液用高盐还是高渗缓冲液配 酶解条件（时间/各种酶的比例） 缓冲液的pH（5.8-7.4） 高渗溶液（有机/无机） 培养基成分 《微生物学实验教程》 周德庆（酵母） 1、接种于液体培养基上培养。 2、取培养液10ml，4000r/min离心5min, 弃上清液，用Tris-HCl(pH 7.4)、0.5mol/LEDTA、高渗缓冲液各洗涤一次。 3、用含10mmol/L巯基乙醇的高渗缓冲液稀释裂解酶液。 4、加酶液，100r/min摇床50-100min酶解。脱壁效果达70%左右即停止酶解。 5、100r/min离心三分钟，去沉淀，取上清。再2000r/min离心10min收集沉淀原生质体。 6、高渗缓冲液洗涤2次，2000r/min离心10min收集原生质体，最终用1ml高渗缓冲液悬浮原生质体。 高渗缓冲液： 蔗糖0.5mol/L, MgCl2 10mmol/L,Tris-HCl(pH 7.4) 10mmol/L 1、原生质体混合、PEG助融 2、双层平板：底层10ml的固体培养基（1.2%琼脂），将样品加入5ml融化后的半固体培养基（0.6%琼脂，预保温42℃）中，快速混