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植物叶绿体色素含量的测定 福建农林大学生命科学学院 植物生理生化实验室 思考题 1、叶绿素a、b在蓝光区也有吸收峰，能否用这一吸收峰波长进行叶绿素ａ、ｂ的定量分析？为什么？ 2、为什么提取叶绿素时干材料一定要用80％的丙酮或乙醇，而新鲜的材料可以用无水丙酮或乙醇提取？ * * 高等植物叶绿体色素 叶绿素 类胡萝卜 叶黄素---C40H56O 胡萝卜素---C40H56 叶绿素b---C55H70O6N4Mg 叶绿素a---C55H72O5N4Mg 叶绿素吸收光谱： 最大吸收区域在蓝紫光部分（400-500nm），基本上不吸收黄光，从而呈现黄色。 ? 类胡萝卜素吸收光谱： 红光区 蓝光区 叶绿体色素提取液中各色素的吸收光谱虽有不同，但又存在着明显的重叠，在不分离的情况下同时测定叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素的浓度，可分别测定在663nm、645nm（分别是叶绿素a和叶绿素b在红光区的吸收峰）和475nm的光吸收，然后根据Lambert-Beer定律，计算出提取液中叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素的浓度。 A663=82.04Ca+9.27Cb　　（1） A645=16.75Ca+45.60Cb　 （2） 将上式整理，可以得到下式： Ca=13.95A665- 6.88A649 Cb=24.96A649 – 7.32 A665 CT= Ca + Cb =18.08A649-6.63 A665 CX.C=(1000A470-2.05Ca-114Cb)/245 叶绿体色素，不溶于水，易溶于乙醇、丙酮等有机溶剂。同时，叶绿体色素在植物细胞内是以色素蛋白复合体的结构存在的。故通常用80%的丙酮或95%乙醇提取叶绿素。 叶绿体色素的提取 为什么要用含有水的有机溶剂提取叶片 中的叶绿素？ 这是因为叶绿素分子结构的“头部”是亲水的，与蛋白质结合很牢，需要经过水 溶解作用才可被提取出来。 实验步骤 1．取2种新鲜玉米（完全/缺素）叶片，擦净组织表面污物，剪碎（去掉中脉），混匀。 2．各称取0.2g，分别放入研钵中，加少量石英砂和碳酸钙粉及2ml95％乙醇，研成匀浆，再加少量95%乙醇，多次研磨至组织发白，静置片刻。 加入少量碳酸钙； 弱光下研磨，速度要快 实验步骤 3．取滤纸1张，置漏斗中，用95%乙醇湿润，沿玻棒把提取液倒入漏斗中，过滤到25ml容量瓶中，用少量95%乙醇冲洗研钵和研棒数次，将液体全部倒入漏斗中。 4．用滴管吸取95%乙醇，将滤纸上的叶绿体色素全部洗入容量瓶中。直至滤纸和残渣中无绿色为止。最后用95%乙醇定容至25ml，摇匀。 残渣中的色素要充分洗脱！ 实验步骤 5．把叶绿体色素提取液倒入光径1cm的比色杯内。以95％乙醇为空白，在波长665nm、649nm和470nm下测定吸光度。 A665 A649 A470 缺素 完全 过滤的比色液不能混浊 95%乙醇提取液中色素计算公式： ① Ca=13.95A665- 6.88A649 ② Cb=24.96A649 – 7.32 A665 CT= Ca + Cb =18.08A649-6.63 A665 ③ CX.C=(1000A470-2.05Ca-114Cb)/245 以上是求出叶绿素总浓度，mg.L-1 按以下公式计算各色素含量(mg.g鲜重-1 ) ： 叶绿体色素含量 = 色素的浓度×提取液体积(L)×稀释倍数 样品鲜重(g) 注意事项： 1、研磨要在弱光下进行，且速度要快； 2、研磨时要加入少量的碳酸钙，保护叶绿素； 3、残渣中的色素要充分洗脱； 4、波长要调准； 5、比色液不能混浊。