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RNA干扰技视膈
RNAi的发现 1998 参与RNAi的主要酶——Dicer酶 1)Dicer酶是RNA酶Ⅲ家族的一个成员。RNA酶Ⅲ是一种能切割双链RNA的酶。Dicer酶参与RNAi反应,广泛存在于蠕虫,果蝇,真菌,植物及哺乳动物。 2)其结构中包括一个螺旋酶结构域,两个RNA酶Ⅲ结构域,一个双链RNA结合位点。Dicer酶的作用下,双链RNA被裂解成21到23个核苷酸的片断,称为siRNA(short interference RNA),它启动了细胞内的RNAi反应 RNAi的反应过程 1) 双链RNA进入细胞后,Dicer酶的作用下被裂解成siRNA 2) 在RdRP的作用下自身扩增后,再被Dicer酶裂解成siRNA; 3) SiRNA的双链解开变成单链,并和某些蛋白形成复合物,同与siRNA互补的mRNA结合,一方面使mRNA被RNA酶降解,另一方面以SiRNA作为引物,以mRNA为模板,在RdRP作用下合成出mRNA的互补链。 4) mRNA也变成了双链RNA,它在Dicer酶的作用下也被裂解成siRNA。这些新生成的siRNA也具有诱发RNAi的作用,通过这个聚合酶链式反应,细胞内的siRNA大大增加,显著增加了对基因表达的抑制。 RNAi的作用机制 siRNA的合成 1)化学合成 2)体外转录 3)长片断dsRNAs经RNaseIII 类降解 4)siRNA表达载体或者病毒载体在细胞中表达siRNAs 5)PCR制备的siRNA表达框在细胞中表达 RNAi的应用 MicroRNA (miRNA): A New Class of Small RNA Molecules siRNA—小干扰RNA stRNA 小时序RNA miRNA microRNA It appears that “ tiny RNA world” may not be so tiny after all What is miRNAs 1、miRNAs是一种18-25nt长的单链小分子RNA,广泛存 在于真核生物中,是一组不编码蛋白质的短序列RNA, 它本身不具有开放阅读框(ORF); miRNAs 的特点: 2、成熟的miRNAs,是由具有发夹结构的约70-90个碱基大 小的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成,成熟的 miRNAs 5’-端的磷酸基团和3′-端羟基是它与相同长度的 功能RNA降解片段的区分标志。 3、miRNA基因常以单拷贝、多拷贝或基因簇等多种 形式存在于基因中。70%~90% 位于基因间隔区, 其余在内含子,极少数在蛋白编码区。 (参阅:“中国生物化学与分子生物学报”2010,26:1) 与siRNA的比较 4、miRNA不仅在结构上保守,而且在物种间具有高度 的进化保守。(5’端的2—8个核苷酸有一定保守性) 5、miRNA具有明显的时空特异性及组织特异性。目前 研究较清楚的 lin-4与lin-7呈时间特异性表达;miR-1 在肌肉组织中特异表达,并且调控肌肉组织的生长、 分化。 1、共同之处:长度(22nt);依赖Diser酶加工;由双 链RNA或RNA前体形成;都形成RISC;作用方式相同。 (参阅:“中国生物化学与分子生物学报”2010,26:1) * RNA 干 扰 技 术 2006年的诺贝尔生理学奖获得者: Andrew Z. Fire Craig C. Mello Introduction of small segments of double- stranded RNA leads to specific degradation of the corresponding mRNA. 一些小的双链RNA(siRNA)可以通过促使特定基因的mRNA降解来高效、特异的阻断体内特定基因表达,诱使细胞表现出特定基因缺失的表型,称为RNA干扰(RNAi)。 RNAi的发现具有划时代的意义,它不仅深入揭示了细胞内基因沉默的机制,而且它还是后基因组时代基因功能分析的有力工具,极大地促进了人类揭示生命奥秘的进程;此外, siRNA本身还是一种极具前景的基因靶向药物,可广泛地用于诸如癌症等疾病的治疗。 RNA 干扰(RNA interference, RNAi) RNAi RNA interference siRNAsSmall interfering RNAs (小干扰性RNA) dsRNAdouble strand RNA(双链RNA) RISCRNA-induced silencing complex (RNA诱导
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