RNA干扰技视膈.ppt

RNAi的发现 1998 参与RNAi的主要酶——Dicer酶 1）Dicer酶是RNA酶Ⅲ家族的一个成员。RNA酶Ⅲ是一种能切割双链RNA的酶。Dicer酶参与RNAi反应，广泛存在于蠕虫，果蝇，真菌，植物及哺乳动物。 2）其结构中包括一个螺旋酶结构域，两个RNA酶Ⅲ结构域，一个双链RNA结合位点。Dicer酶的作用下，双链RNA被裂解成21到23个核苷酸的片断，称为siRNA（short interference RNA），它启动了细胞内的RNAi反应 RNAi的反应过程 1) 双链RNA进入细胞后，Dicer酶的作用下被裂解成siRNA 2) 在RdRP的作用下自身扩增后，再被Dicer酶裂解成siRNA； 3) SiRNA的双链解开变成单链，并和某些蛋白形成复合物，同与siRNA互补的mRNA结合，一方面使mRNA被RNA酶降解，另一方面以SiRNA作为引物，以mRNA为模板，在RdRP作用下合成出mRNA的互补链。 4) mRNA也变成了双链RNA，它在Dicer酶的作用下也被裂解成siRNA。这些新生成的siRNA也具有诱发RNAi的作用，通过这个聚合酶链式反应，细胞内的siRNA大大增加，显著增加了对基因表达的抑制。 RNAi的作用机制 siRNA的合成 1）化学合成 2）体外转录 3）长片断dsRNAs经RNaseIII 类降解 4）siRNA表达载体或者病毒载体在细胞中表达siRNAs 5）PCR制备的siRNA表达框在细胞中表达 RNAi的应用 MicroRNA (miRNA): A New Class of Small RNA Molecules siRNA—小干扰RNA stRNA 小时序RNA miRNA microRNA It appears that “ tiny RNA world” may not be so tiny after all What is miRNAs 1、miRNAs是一种18－25nt长的单链小分子RNA,广泛存 在于真核生物中，是一组不编码蛋白质的短序列RNA， 它本身不具有开放阅读框（ORF）； miRNAs 的特点： 2、成熟的miRNAs，是由具有发夹结构的约70-90个碱基大 小的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成，成熟的 miRNAs 5’-端的磷酸基团和3′-端羟基是它与相同长度的 功能RNA降解片段的区分标志。 3、miRNA基因常以单拷贝、多拷贝或基因簇等多种 形式存在于基因中。70%～90% 位于基因间隔区， 其余在内含子，极少数在蛋白编码区。 (参阅：“中国生物化学与分子生物学报”2010，26：1) 与siRNA的比较 4、miRNA不仅在结构上保守，而且在物种间具有高度 的进化保守。（5’端的2—8个核苷酸有一定保守性） 5、miRNA具有明显的时空特异性及组织特异性。目前 研究较清楚的 lin-4与lin-7呈时间特异性表达；miR-1 在肌肉组织中特异表达，并且调控肌肉组织的生长、 分化。 1、共同之处：长度（22nt）；依赖Diser酶加工；由双 链RNA或RNA前体形成；都形成RISC；作用方式相同。 (参阅：“中国生物化学与分子生物学报”2010，26：1) * RNA 干 扰 技 术 2006年的诺贝尔生理学奖获得者： Andrew Z. Fire Craig C. Mello Introduction of small segments of double- stranded RNA leads to specific degradation of the corresponding mRNA. 一些小的双链RNA(siRNA)可以通过促使特定基因的mRNA降解来高效、特异的阻断体内特定基因表达，诱使细胞表现出特定基因缺失的表型，称为RNA干扰（RNAi）。 RNAi的发现具有划时代的意义，它不仅深入揭示了细胞内基因沉默的机制，而且它还是后基因组时代基因功能分析的有力工具，极大地促进了人类揭示生命奥秘的进程；此外， siRNA本身还是一种极具前景的基因靶向药物，可广泛地用于诸如癌症等疾病的治疗。 RNA 干扰（RNA interference, RNAi） RNAi RNA interference siRNAsSmall interfering RNAs (小干扰性RNA) dsRNAdouble strand RNA(双链RNA) RISCRNA-induced silencing complex (RNA诱导