试验8Folin-酚试剂法测定蛋白质含量Lowry基本法.PPT

实验8 Folin-酚试剂法测定蛋白质含量（Lowry基本法） 一 目的与要求 Folin-酚试剂法测定蛋白质含量的原理和方法。 二 实验原理 Folin-酚试剂（Folin-phenol reagent）的显色原理主要是：试剂中的磷钼酸-磷钨酸混合物被蛋白质还原，形成多种还原型的混合酸，并且有特殊的蓝色。包括两步反应。 ㈠ 试剂甲使蛋白质发生烯醇化反应，在碱性条件下，形成蛋白质-铜络合物，从而使电子转移到混合酸中，大大地增强了酚试剂对蛋白质的敏感性。 ㈡ 试剂乙（磷钼酸-磷钨酸混合液）受蛋白质中半胱氨酸、酪氨酸、色氨酸和组氨酸等作用，使钨酸、钼酸两者同时失去1个、2个或3个氧原子，还原成含有多种还原型的混合酸，并且有特殊的蓝色。 利用蓝色深浅与蛋白质浓度的关系，可制备标准曲线，测定样品中蛋白质含量。本法可测定的蛋白质含量为15-280?g/mL。 三 操作步骤㈠ 标准曲线制作 ⒈ 取试管6支，编号。按表7-2操作，加入牛血清白蛋白标准溶液（200?g/mL），补足蒸馏水，使各管容量达1mL。算出各管中实际蛋白质含量，然后按顺序加入定量试剂甲、乙（各管加入乙试剂必须快速，并立即摇匀！），在分光光度计以上波长500nm比色，读取光密度。 2. 以各标准溶液浓度为横坐标，各管的光密度为纵坐标作图，得标准曲线。 标准曲线必须从零点开始出发，最好能成一直线。画好后，注明所用仪器的型号及编号、所用波长及测定方法、名称及制作日期。 ㈡ 样品测定 取试管3支，分为测定管和空白管和标准管。测定管内加入1mL待测样品溶液（适当稀释至25-280?g/mL蛋白质）。操作步骤与制作标准曲线相同，见表7-3。 四 结果与计算 根据光密度读数查得标准曲线，计算检测液内的蛋白质含量。进一步可根据检测溶液的稀释倍数及实际所要求的蛋白质浓度换算。本实验要求蛋白质含量浓度以g/L为单位，也可以与测定管同样操作的标准管按下式计算蛋白质含量。 测定管蛋白含量= ×标准管蛋白质含量 * * 表7-2 Folin-酚试剂法标准曲线制作步骤 1.0 0 6 0.8 0.2 1 0 1.0 5 0.4 0.6 3 0.2 0.8 4 0.6 0.4 2 OD500 各管加试剂甲2.5mL，混匀放置10min后，加入试剂乙0.25mL，立即混匀，放置30min 蒸馏水/mL 牛血清蛋白 标准溶液/mL 管号 0 1.0（标准液） 标准管 OD500 各管加试剂甲2.5mL，混匀放置10min后，加入试剂乙0.25mL，立即混匀，放置10min后比色。 1.0 ?0 待测液mL 0 测定管 1.0 空白管 蒸馏水mL 测定管光密度 标准管光密度