蛋白质篮晚化性质.pptVIP

复旦大学生物化学系 黄伟达 蛋白质的理化性质和分离纯化手段 蛋白质的理化性质 蛋白质的理化性质 蛋白质溶液是一种胶体溶液； 特定的空间构象，分子量一定 分子筛层析； 在大部分pH条件下，蛋白质分子同时存在两种电荷 等电点沉淀，盐溶，盐析，电泳，离子交换层析等； 一般而言，蛋白质分子上同时存在疏水和亲水区域 有机溶剂沉淀，疏水层析(反相层析)； 蛋白质分子上的电荷与疏水区 蛋白质在等电点的溶解度最小 蛋白质的盐析 几种常用的电泳 等电聚焦 纸电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 O’Farrell的双向电泳 O’Farrell的蛋白质双向电泳 蛋白质的分离纯化 蛋白质分离纯化的基本原则 选择好的材料 摸清目的蛋白质的稳定性 探索有效的抽提法和浓缩法 建立一套层析的组合 以较好的方法贮存  初提 精纯化 盐析 ? 离子交换层析 有机溶剂沉淀 ? 分子筛层析 等电点沉淀 ? 疏水/反相层析 结晶 ? 亲和层析 分离效果差异与理论塔板数N相关 理论塔板数与粒子半径成反比 HPLC层析系统 填充物的多孔化可以减少层析压 灌注层析示意 蛋白质分离纯化中常用的层析 分子筛层析 离子交换层析 疏水/反相层析 亲和层析 物理吸附层析 分子筛层析的工作原理 离子交换层析原理 反相层析中的离子配对试剂的作用 蛋白质定性定量分析 蛋白质分子量的确定方法 超离心法: M=RTs/[(1-υρ)D] 凝胶过滤: v=k + clogM SDS－PAGE法: d=k + clogM 光散射法: M=τ/Hc 渗透压法: M=cRT/Π 蛋白质的定量法 克氏(Kjeldahl)定氮法: 浓硫酸加热降解蛋白质后测定NH3 双缩脲(biuret)法: CuSO4与肽链的氨基结合 Folin-Phenol法: 芳香族氨基酸侧链发色 紫外法: 280纳米处的紫外吸收 (1 OD280 = 1 mg/ml) Bradford法: 考马斯亮兰 ( Coomassie brilliant blue G250)与肽链结合后吸收谱变化 BCA (bicinchoninic acid)法: FDA唯一认可 蛋白质紫外吸收定量计算 光吸收值 A 的Beer-Lambert公式: A = kcl = log (Io/I) = -log T, T (透过率,%) = I / Io ; k, 消光系数; c, 摩尔浓度; l, 样品池长度; I, 光强度 对混合蛋白质样品, 1 OD280nm ≈ 1 mg/ml 对特定蛋白质的光吸收值的理论值: A280(1 mg/mL) = (5690Nw + 1280Ny + 120 Nc)/M Nw,Ny和Nc分别为Trp,Tyr和Cys的数量, M为分子量; Scopes的经验公式: A2051 mg/ml = 27 + 120 (A280/A205) 蛋白质也可以下列经验公式定量: Protein concentration(ug/ml) = 144 (A215 -A225) 有核酸混入时, 有三种近似计算法: Protein concentration (mg/ml) = 1.55A280 - 0.76A260 Protein concentration (mg/ml) = (A235 -A280)/2.51 Protein concentration (mg/ml) = 0.813A230 - 0.0758A260 有一蛋白质分子量14kDa, pI 10.2, 65℃不变性, 50%酒精不沉淀, 请设计分离纯化方案。 蛋白质的定量法 蛋白质紫外吸收定量计算 The Protein Protocols Handbook , by John M.Walker, Humana Press. 思考题 * 蛋白质的理化性质 疏水区域 蛋白质分子上的电荷与疏水区 蛋白质在等电点的溶解度最小 pH与盐浓度对蛋白质溶解度的共同作用 硫酸铵对马血红蛋白的溶解度的影响 离子强度 盐 析 盐溶 蛋白质的盐析 1708年Reuss的实验 1930年Tiselius的装置 最早的电泳装置 最早的电泳装置 19