慢病毒载体介导的绿色荧光蛋白转基因标记法研究猪嵌合体制.PDF

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１２，３２（８）：６８７４ 慢病毒载体介导的绿色荧光蛋白转基因 标记法研究猪嵌合体制作 石永乾　何文腾　周　洋　焦明霞　解炳腾　胡　魁　孔庆然　刘忠华 （东北农业大学生命学院　哈尔滨　１５００３０） 摘要　目的：通过建立慢病毒载体感染猪胚胎体系实现胚胎标记，进而研究不同发育阶段猪孤雌 胚胎之间的嵌合能力，为进一步研究猪早期胚胎发育以及细胞分化奠定基础。方法：首先，通过 ９ ８ ７ 显微注射的方法把２×１０Ｉ．Ｕ．／ｍｌ、２×１０Ｉ．Ｕ．／ｍｌ和２×１０Ｉ．Ｕ．／ｍｌ三个梯度的表达绿色荧光 的慢病毒载体分别注射到猪１细胞胚胎和２细胞胚胎的透明带下，进行胚胎的ＧＦＰ转基因标记， 在荧光显微镜下观察比较卵裂率、阳性胚胎率、囊胚率、阳性囊胚率和囊胚细胞数。然后，采用凹 窝聚合法对同步发育胚胎在不同阶段（２细胞，４细胞，８细胞）进行嵌合，２细胞胚胎与不同发育 阶段（２细胞、４细胞、８细胞）胚胎进行嵌合以及２细胞胚胎卵裂球互换制作嵌合体胚胎，发育到 ９ 囊胚时在荧光显微镜下检测胚胎的嵌合状态。结果：２×１０Ｉ．Ｕ．／ｍｌ的慢病毒感染猪２细胞胚胎 组中，体外受精和孤雌胚胎感染阳性率（８０．００％、７６．３６％）和阳性囊胚率（９０．７４％、８９．５６％）都 显著高于其它滴度组（Ｐ＜０．０５），另外，慢病毒感染的两种胚胎与对照组对卵裂率、囊胚率和囊胚 细胞数三个指标没有显著影响（Ｐ＞０．０５）。２细胞胚胎之间嵌合囊胚率和２细胞卵裂球互换嵌 合囊胚率（５３．８５％、６２．５０％）显著高于２细胞胚胎与４细胞胚胎的嵌合率（１８．６０％，Ｐ＜０．０５）， 在同步发育胚胎中８细胞胚胎之间的嵌合率（７５．００％）高于４细胞胚胎之间和２细胞胚胎之间 ９ 的嵌合率（６５．００％、５３．８０％）。结论：２×１０Ｉ．Ｕ．／ｍｌ的慢病毒感染２细胞期胚胎效率最高，另 外，慢病毒感染对猪胚胎发育没有明显影响。８细胞间的嵌合率比较高；发育同步胚胎间的嵌合 率高于发育非同步胚胎间的嵌合率。 关键词　慢病毒载体　绿色荧光蛋白　聚合法　嵌合 中图分类号　Ｓ８１３．１ 　　嵌合体是指将两种或多种具有不同遗传性状的胚 上，或将体外培养的细胞注入到一个囊胚里，从而得到 ［４］ 胎或多能性细胞和早期胚胎聚合或经显微注射后所发 两种细胞系的嵌合体；１９８１年，Ｅｖａｎｓ等 进行了大量 ［１］ 的嵌合实验，找到了一种具有高效嵌合能力的全能性 育产生的一个个体 ，最早进行嵌合动物研究的是 Ｓｐｅｒｍａｎ，他在１９０１年就培育出蛙的嵌合体。在哺乳动 细胞系（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌ，ＥＳｃｅｌｌ），通过显微注射到 ［２］ 囊胚腔制作嵌合体，成为目前主要的胚胎干细胞嵌合 物中，２０世纪６０年代Ｔａｋｏｗｓｋｉ 首次利用两种不同毛 ［５］ 色的小鼠胚胎，在不同的卵裂球时期进行胚胎嵌合，成 体研究手段。１９９２年柏崎等 采用囊胚注入法，将一 功获得第一只嵌合鼠。至此，嵌合体技术受到极大重 种白色毛系的内细胞团ＩＣＭ注入到褐色毛系的受体囊 ［３］ 胚中，获得世界上首例嵌合体猪。但目前关于小鼠嵌 视，Ｇａｒｄｎｅｒ 在１９６８年创建了囊胚注射法嵌合技术，