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GST亲和层析介质使用说明书
GST亲和层析介质使用说明书
一、?? 简介
GST亲和层析介质(GST Agarose)是专门设计用于纯化谷胱甘肽S-转移酶(GST)融合蛋白、其它谷胱甘肽转移酶以及与谷胱甘肽有亲和作用蛋白的分离介质,一步分离就可得到高纯度的GST融合目标蛋白,纯化条件温和,可以保证蛋白的活性。
本产品是自主设计合成的GST琼脂糖凝胶,具有优良的物理和化学稳定性,使用寿命长,操作方便,批次重复性好,易于放大,是研发与生产的理想选择。
二、?? 性能参数
特点 基团密度高,载量大 基质 6%的交联琼脂糖凝胶 吸附载量 ≥15mg GST融合蛋白(55kDa)/ml 介质平均粒径 100μm 最大流速 300cm/h pH范围 3~10,在位清洗时pH范围可到2~11 使用温度 常温 保存温度 +4~8℃ 保存液体 20%乙醇 化学稳定性 室温下可在0.1M柠檬酸(pH 4.0),0.1 M NaOH,70%乙醇或6M盐酸胍中耐受2h,蛋白结合能力不受影响 三、?? 适用范围
分离谷胱甘肽S-转移酶(GST)融合蛋白、其它谷胱甘肽转移酶以及与谷胱甘肽有亲和作用的蛋白。
四、?? 操作说明
1.? 缓冲液配制
?????? 缓冲液A(平衡缓冲液):10mM Na2HPO4,1.8mM KH2PO4,140mM NaCl,2.7mM KCl,调节pH值至8.0。
?????? 缓冲液B(洗脱缓冲液):10mM Glutathione(还原型),50mM Tris-HCl,调节pH值至8.0。因Glutathione易氧?? 化,需现用现配。
(注:各种溶液配制完毕后,最好进行脱气处理,0.45 μm滤膜过滤备用)。
2.? 样品预处理:
按每克湿重菌体/2~5ml平衡缓冲液的比例充分悬浮离心收集的菌体;600w功率,每循环超声3s,冷却3s,循环99×3次,破碎菌体;4、15000rpm离心15m,收集上清液,或用0.45μm滤膜过滤。
3.???装柱:
??????聚苯乙烯层析柱
1)??将层析柱固定在铁架台或层析架上,封闭层析柱下端出口,向柱内充入纯水,排开层析柱内空气,先将垫片完全浸没于水面下方,在保持水平的状态下,小心推向底部,避免垫片下方滞留气泡。
2)??打开层析柱下端出口,排出柱中纯水;在液面低至距垫片1~1.5cm高度时封闭下端出口,用移液枪按需要量吸取介质,或用玻璃棒紧靠柱子内壁引流,将介质加入到层析柱中;静置30min,让介质自然沉降。
3)??从上端管口将另一垫片缓慢推至介质沉降平面,使介质表面保持水平状态,注意避免垫片与介质接触面滞留气泡(如对实验结果要求不严,也可不放入上垫片,以提高流速)。
4)??在使用一段时间后,如果层析柱流速减慢,可先用小镊子沿边缘将垫片推翻,夹出垫片,倒出介质,清洗或更换新的垫片后,按2)、3)所述
???? 玻璃层析柱
1)??将层析柱洗净后垂直固定到铁架台上;向柱中加入蒸馏水,排开柱子中的空气,在蒸馏水排尽以前,关闭柱子出口,在柱内保留5~8cm高度的蒸馏水。
2)??先将介质混匀,用移液枪按需要量吸取介质,或用玻璃棒紧靠柱子内壁引流,将介质加入到层析柱中;静置30min,让介质自然沉降。
3)??从上端管口将转换杆出液端缓慢推至介质沉降平面,使介质表面保持水平状态,注意避免转换杆与介质接触面间滞留气泡。
4)??在使用一段时间后,如果流速减慢,可先卸下上转换杆,将介质倒出,再取出下转换接头中滤网,清洗或更换后重新装柱。
4.??过柱:
1)? 用10倍介质体积缓冲液A过柱,平衡介质;
2)? 上样;
3)???用5~10倍介质体积缓冲液A过柱,洗去层析柱中剩余上样液并重新平衡介质;
4)???用5~10倍介质体积缓冲液B洗脱,收集洗脱液;
5)???用5~10倍介质体积缓冲液A重新平衡介质。
注:纯化过程流速不宜过快,对于1ml介质,流速保持在0.5ml/min为宜。
5.? 介质清洗
如果在使用一段时间后,介质因表面沉积过多杂质导致蛋白结合能力下降,需对介质进行清洗。步骤如下:
1)? 沉淀或变性物质的清洗:
用2倍介质体积6 M盐酸胍清洗,然后用5倍介质体积缓冲液A平衡介质。
2) ?疏水缔合物质的清洗:
用3~4倍介质体积70%乙醇 (或2倍介质体积去垢剂,如 1% Triton? X-100) 清洗介质;然后用5倍介质体积缓冲液A平衡介质。
6.?介质再生
每次层析前,为达到最佳纯化效果,需对介质进行再生,步骤如下:
1)? 2倍介质体积高pH缓冲液(0.1M Tris-HCl, 0.5M NaCl, pH8.5)和低pH缓冲液(0.1M sodium acetate, 0.5M NaCl, pH4.5)交替洗脱三次。
2)?10倍介质体积缓冲液A平
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