实时荧光定量RT-PCR原理及应用.ppt

3、改进实验操作： (1) 带一次性手套； (2) 避免反应液的飞溅； (3) 用一次性移液器或吸头，吸头不要暴露于空气，以免产物气溶胶污染； (4) 操作多份样品时，要先将可混匀的成分(dNTPs，缓冲液，引物等)一起制备标准混合液(Master mix)； (5) 制备反应混合液时，最后加入样品DNA，加入DNA后，在进行下一步操作前要盖紧反应管。 4、检查结果的可重复性。 1、阳、阴性对照 阳性对照：应选择扩增弱，重复性好的样品。 阴性对照：不含模板DNA的PCR试剂对照。 （二）污染源的追踪 2追踪可疑的环境污染源 ① 用去离子浸湿的灭菌棉签擦试可疑部分 ② 在0.1ml 去离子水中浸泡； ③ 取5μl 作PCR反应； ④ 电泳检查结果。 四 因操作欠规范导致的问题分析 离心机： ①离心前，离心管须配平； ②将调速档打至0档位，才能打开电源开关，逐渐升高转速，直至即定转速； ③定时旋钮不能强行归零； ④转头未停止时，严禁打开盖板。 （一）仪器使用不当引起的污染问题 移液器： ①严禁大力来回拧动； ②严禁调至容量之外使用； ③第二档为排空档，不得作吸取之用； ④吸头应浸入液面2—3mm处吸取； ⑤严禁将有液体的移液器平放或倒置； ⑥混匀沉淀时，将吸头紧贴于沉淀上方管壁，反复吸取液体，将沉淀反复混匀，溶解； ⑦每周用75%乙醇清洗一次，若有污染随时清洗。 （二）实验室布局不合理引起的污染问题 1、样品处理不进行隔离，样品中各种核酸片段均会通过空气进行传播。 2、PCR结果检测实验室和其它实验室在一起，会出现严重的扩增子污染。 3、仪器设备及工作服等（尤其是加样器）公用，也会造成严重污染。 4、实验室操作垃圾（吸头、离心管、样品杯 等）放，飘散在空气中的核酸片段、病原微生物可造成实验室污染。 基础研究：不同组织、用药前后、不同发育阶段 基因表达异的检测 临床：细菌、病毒、寄生虫等病原体的检测 DNA、mRNA病毒荷载量的定量 肿瘤标志物和肿瘤相关/耐药基因的检测 食品卫生检疫：转基因食品 瘟疫流行地区进口的食品 点突变分析和等位基因分析 单核苷酸多态性（SNP）分析 DNA甲基化检测 医疗方面的部分应用（1）： 临床检测： 疾病的临床早期诊断 如各种肝炎、性病、遗传性疾病、与优生优育相关的疾病以及肺结核等等 建立病原体病分子诊断标准 疗效考评 指导制订感染性疾病合理治疗方案 了解感染性疾病病人用药后病情的变化情况 医院、血站及防疫站的确诊 研究Elisa方法的漏检率 病毒性疾病中病毒的耐药性变异株的测定，为疾病治疗进行指导 医疗方面的部分应用（2）： 遗传病诊断 ： 等位基因检测 多基因遗传病的突变检测 基因表达异常所致遗传病检测 医疗方面的部分应用（3）： 肿瘤诊断 ： 肿瘤相关基因表达的检测 ：包括癌基因抗癌基因、肿瘤转移基因及转移抑制基因 肿瘤标志物 如癌胚抗原、同功酶、抗体、激素、细胞因子、受体等 肿瘤耐药基因（MDR） 研究方面的部分应用（1）： 药物相关 ： 新药开发研究 超早期感染用药物及疗法的研究与开发 药物疗效研究 新的愈后指标的研究 个人基因型与药物疗效之间的关系 研究方面的部分应用（2）： 检测相关 ： 新临床诊断及检验试剂的开发 血液检验漏检率 商业检测用检验试剂的开发 有病毒类、细菌类、昆虫类等 转基因动植物检验试剂的开发 其他方面的部分应用（1）： 商业检测相关 ： 动物检疫，如各种动物流行病 植物检疫，如各种植物流行病 有害动物，特别是昆虫 食品检测，如各种有害病原微生物，如病毒、细菌 转基因植物检验，如转基因大豆、西红柿等 其他方面的部分应用（2）： 公安系统相关 ： 个人身份鉴定 物证的各种鉴定 人种的鉴定 考古方面 物种分类 * 不正确的基线设置 基线终止循环数太低 基线终止循环数太高 阈值的缺省值是基线荧光信号强度标准偏差的10倍 可以将阈值线的光标移到符合下列条件的扩增曲线的位置： 指数扩增的线性阶段，精度最大、敏感性最大 确 定 最 佳 阈 值 标准曲线法 斜率的绝对值接近3.322 R2接近1 较好的区分样品 重复 平行样的Ct值之间的差0.5 使用SYBR green I进行定量PCR 采用Primer Express设计引物，原则同TaqMan Primer and Probe design设计规则，但只需合成引物 将荧光染料设为SYBR,淬灭剂设为none 在PCR扩增之后，设置解离曲线 运行结束后，输出Multicomponent