RT-PCR原理及载拟体选择.pptVIP

制作人：陈丽园 * * 表达载体 表达载体（Expression vectors）就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、RBS、终止子等），是目的基因能够表达的载体。 表达载体是基因表达的核心元件。 * 实时荧光定量PCR 实时荧光定量PCR技术(RT-PCR) 是一种在PCR反应体系中加入荧光基团利用荧光信号的积累实时监测整个PCR反应的进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 * RT-PCR 原理 荧光阈值 是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在 荧光信号指数扩增阶段任意位置上，一般荧光域值的设置是基线 （背景）荧光信号的标准偏差的 10 倍。 * RT-PCR 原理 CT值 是指每个反应管内的荧光信号到达设定的 域值时所经历的循环数——具有重现性。 * RT-PCR的数学原理 * CT * PCR 反应的对照 * PCR 反应条件 * TaqMan 探针法 * SYBR Green I荧光染料法 　　SYBR Green I是一种只与dsDNA小沟 结合的具有绿色激发波长荧光染料。 * SYBR Green I—原理 * 两种方法的比较 * 荧光定量的解析方法 * PCR 反应体系 10×PCR Buffer(含Mg2+ ) 2 uL dNTPs(各2.5mmol/L) 2 uL 引物(10umol/L) 各1 uL 模板 20～40 ng rTaq DNA聚合酶 0.5 U±  加双或三蒸水至 20 uL * 绝对定量分析法 根据起始浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可 做出标准曲线，再根据样品的CT值就可以计算出样品所含的模板量。 制作人：陈丽园