2014-5-6 PI法细胞值能期检测.docVIP

 HYPERLINK /experiment/106.htm 细胞周期检测（PI法） 一、实验方法原理 细胞周期（cell cycle)：是指细胞从前一次分裂结束起到下一次分裂结束为止的活动过程，通常由G0/G1期、S期、G2期和M期组成。G1期：细胞开始RNA和蛋白质的合成，但DNA含量仍保持二倍体。S期：DNA开始合成，这时细胞核内DNA的含量介于G1期和G2期之间。当DNA复制结束成为4倍体时，细胞进入G2期。G2期的细胞继续合成RNA及蛋白质，直到进入M期。因此，单纯从DNA含量无法区分G2期和M期。一旦有丝分裂发生，细胞分裂成两个细胞，这两个细胞或者进入下一个细胞周期，或者进入静止期（G0期），而G0期从DNA含量上同样无法与G1期区分。因此，整个复制周期可以描述为G0/G1、S、G2/M期。通过核酸染料PI标记DNA,并由流式细胞仪进行分析，可以得到细胞各个时期的分布状态，计算出G0/G1%、S%、G2/M%，了解增殖能力，在肿瘤病理学研究中，通常以S期细胞比率作为判断肿瘤增殖状态的指标。 流式细胞仪的工作原理：是将待测细胞放入样品管中，在气体的压力下进入充满鞘液的流动室。在鞘液的约束下细胞排成单列由流动室的喷嘴喷出，形成细胞柱。通过对流动液体中排列成单列的细胞进行逐个检测，得到该细胞的光散射和荧光指标，分析出其DNA特征。 细胞周期检测的原理：PI法是较常见的一种周期检测方法。PI为插入性核酸荧光染料，能选择性的嵌入核酸DNA和RNA双链螺旋的碱基之间与之结合，其结合的量与DNA的含量成正比例关系，用流式细胞仪进行分析，就可以得到细胞周期各个阶段的DNA分布状态，从而计算出各个期的百分含量。PI染色后，假设G0/G1期细胞的荧光强度为1，那么含有双份基因组DNA的G2/M期细胞的荧光强度的理论值为2，正在进行DNA复制的S期细胞的荧光强度为1-2之间。 细胞周期示意图如（图一）所示 （图一） 二、材料及准备工作 1.材料准备 试剂、耗材名称品牌货号细胞培养瓶corning6孔板corning10ml离心管国产1.5ml EP管国产胰酶（无EDTA）贝博试剂盒中包括 HYPERLINK /product/s?wd=RNase-At=3 \t _blank RNase-A贝博试剂盒中包括PI贝博试剂盒中包括无水乙醇国产PBS自配 2. 试剂配制 10X HYPERLINK /product/s?wd=PBSt=3 \t _blank PBS液体配方（0.1MPBS pH 7.4） 以1L量为例： NaCl 80g Na2HPO4·12H2O 32.3g NaH2PO4·2H2O 4.5g（十二水合磷酸氢二钠和二水合磷酸二氢钠）加双蒸水900mL 左右，用HCl/NaOH 调pH至7.4，最后定容为1000mL。 使用时用去离子水稀释成1X HYPERLINK /product/s?wd=PBSt=3 \t _blank PBS 3.仪器设备  HYPERLINK /product/s?wd=%E6%B5%81%E5%BC%8F%E7%BB%86%E8%83%9E%E4%BB%AAt=1 \t _blank 流式细胞仪； HYPERLINK /product/s?wd=%E7%BB%86%E8%83%9E%E5%9F%B9%E5%85%BB%E8%AE%BE%E5%A4%87t=1 \t _blank 细胞培养孵箱； HYPERLINK /product/s?wd=%E7%A6%BB%E5%BF%83%E6%9C%BAt=1 \t _blank 离心机； HYPERLINK /product/s?wd=%E6%B0%B4%E6%B5%B4t=1 \t _blank 水浴； HYPERLINK /product/s?wd=%E5%86%B0%E7%AE%B1t=1 \t _blank 冰箱； HYPERLINK /product/s?wd=%E7%A6%BB%E5%BF%83%E7%AE%A1t=1 \t _blank 离心管； HYPERLINK /product/s?wd=%E5%B0%81%E5%8F%A3%E8%86%9Ct=1 \t _blank 封口膜； HYPERLINK /product/s?wd=%E5%BE%AE%E9%87%8F%E7%A7%BB%E6%B6%B2%E5%99%A8t=1 \t _blank 移液器 三、 实验步骤及注意事项：（采用贝博公司的细胞周期检测试剂盒） 细胞样品的准备： 单次流式细胞仪检测，1份样品细胞数量约1