RAPD技术及其在烟草的上的应用11.docVIP

RAPD 标 记 在 烟 草 研 究 中 的 应 用* 时 焦 徐建华 赖禄祥 韩锦峰 摘要 随机扩增多态DNA (Randomly Amplified Polymorphic DNAs, RAPD) 分子标记技术的诞生，为分子生物学技术在农业研究中的应用注入了新的活力，并为传统农业研究向分子水平发展提供了捷径。本文重点综述了RAPD分子标记技术在烟草群体分离分析和鉴定、标记辅助选择、遗传变异的识别、烤烟品种分子指纹分析、黑胫病菌全基因组DNA多态性标记、根结线虫种类鉴定、赤星病菌分类地位等方面的研究进展，及这些领域的研究发展和应用前景。 关键词： 烟草 RAPD 分子标记 研究 中图分类号： 文献标示码：B 文章编号： 传统育种是从分离群体中选择优良基因型，在各世代中根据个体或称表现型进行筛选。植物的表现型是基因型、环境以及二者互作的结果。基因型和环境作用的区分对于数量性状（如产量和质量）来说是相当困难的。因为在多种不同的环境条件下进行鉴定是育种选择所必须的，这也使得筛选过程繁琐，耗资巨大。传统的病原物分类是根据形态特点、生理生化特性、生物鉴定等进行的，病原物的形态特点常随环境条件、寄主范围的变化而变化，这易造成一些病原物的命名混乱，给病害研究带来困难。同时传统的度量烤 * 时 焦，女，河南农业大学在读博士，郑州文化路95号，450002；青州烟草研究所副研究员，山东青州，262500 徐建华，青州烟草研究所， 赖禄祥, 福建三明烟草分公司，福建，三明，365001 韩锦峰, 河南农业大学， 收稿日期： 2000-07-24 烟亲本间遗传差异和检验种子纯度的方法是观测形态性状和测定生化指标，这限制了遗传差异评价和种子纯度检验的客观性和准确性。分子标记直接在DNA水平上阐明差异，与基因表达无关，从而为遗传差异评价和种子纯度检验提供了强有力的手段。 从20世纪60年代Hubby 和Lewontin 对 Drosophila psuedoobscura 多态性蛋白质的研究[1]开始，人们逐步认识到自然界生物群体中存在着广泛的多态性。 1980年Bostein[2] 等率先提出限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP）可用作遗传标记，这揭开了直接应用DNA多态性开展遗传标记的新篇章。自1987 年聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction, PCR）[3]技术问世以来，就以其迅猛的发展速度几乎冲击到分子生物学的所有领域[4]，一系列以核酸扩增为基础的分子标记技术，如RAPD 、扩增片段长度多态性(Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP)、序列特征扩增区段(Sequence Characterized Amplified Regions，SCAR)、简短序列重复(Simple Sequence Repeats，SSR)等[5,6]应运而生。这不仅克服了传统遗传标记易受环境影响、费时、费力的缺陷，而且使得许多优良基因可在实验室中得到鉴定[7]，使植物病原物的鉴定从形态走向基因型[8]。 1990年Williams[9]和Welsh[10]创立了RAPD方法，利用随机引物来扩增基因组DNA随机片段，再利用随机片段的多态性作为遗传标记。这种方法实验过程简单，也不需知道被测生物DNA序列，并且能快速、有效地检测DNA序列的多态性。因此RAPD技术自其问世以来发展和应用相当迅速，到目前为止已在物种多态性的检测，亲缘关系、物种及品种的鉴定，系谱分析，遗传作图，基因组专一性标记在染色体上的定位[7]5个主要方面得到应用。 1. RAPD标记原理 用PCR技术进行DNA体外扩增，需要DNA多聚酶、引物、模板等。RAPD标记的产生基于这样一种可能性，即一段与某一单一引物同源的DNA序列，有可能在DNA模板另一链上的不同位置上出现，这些位置之间的距离又处于可通过PCR进行扩增的长度范围，因此，当条件满足时，单个寡核苷酸引物就可以在PCR反应中介导DNA呈几何级数扩增。在实际操作中，当新用的引物为10聚体寡核苷酸时，每个引物通常可以产生几个（3～10）不连续的DNA 扩增产物。一般认为这些产物是由不同的遗传位点产生的。多态性是由突变或重排造成的，这些变化可以发生在引物结合位点上，也可以位于引物结合序列之间。经RAPD检测，则大多表现为某个扩增产物出现与消失[11]。再用电泳法分离扩增的DNA片段，就可使某一物种在琼脂凝胶上出现特定的DNA谱带，而另一物种无这种特异DNA扩增谱带，即产生了DNA片段的多态性，从而就可根据对所产生的DNA多态性的分析进行遗传作图或