高通量RNA测序技术.pptVIP

RNA-Seq技术背景 多种高通量RNA-Seq技术方法 高通量RNA-Seq技术应用及前景 测序方法的发展 RNA-Seq原理 RNA-Seq技术优势 454测序技术 SOLiD技术 HeliScope测序技术 Solexa测序技术 第一代测序技术 1954年，首次利用多聚核糖核苷酸链的降解法实现DNA测序 第一代测序技术主要代表为： sanger法：由于ddNTP的2′和3′都不含羟基，在DNA合成反应中不能形成磷酸二酯键，因此可以被用来中断DNA合成反应。在4个DNA合成反应体系中分别加入一定比例的带有放射性同位素标记的某种ddNTP，通过凝胶电泳和放射自显影后，可以根据电泳带的位置确定待测分子的DNA序列。 Gilbert法：与sanger法原理相类似，区别在于Gilbert法是先用特定的化学试剂标记碱基再用化学方法打断待测序列，而Sanger法是通过ddNTP随机中断合成待测序列。 此外还有焦磷酸测序法、连接酶测序法、杂交测序法等。 第一代测序法存在的弊病：成本高、速度慢、通量低。 第二代测序技术—高通量测序技术 Roche公司的454测序技术——焦磷酸测序法 Illumina公司的Solexa技术 ABI公司的SOLiD技术——连接酶测序法 与第一代技术相比第二代测序技术不仅保持了高准确度，而且大大降低了测序成本并极大地提高了测序速度。使用第一代Sanger的测序技术完成的人类基因组计划，花费了30亿美元巨资，用了三年的时间；然而，使用第二代SOLiD的测序技术，完成一个人的基因组测序现在只需要一周左右的时间。由于第二代测序技术产生的测序结果长度较短，因此比较适合于对已知序列的基因组进行重新测序，而在对全新的基因组进行测序时还需要结合第一代测序技术。 第三代测序技术—单分子测序 2008 年, Helicos Biosciences 公司开发了第一台单分子测序仪—HeliScope 遗传分析系统, 与上述3 种高通量测序技术不同的是, 它通过在单一DNA 分子组成的阵列上进行合成测序, 跨越了文库制备中基于PCR 扩增的信号放大过程,避免了该过程可能引入的错误, 达到了读取单个荧光分子的能力。 将以上介绍的第二代、第三代测序技术（高通量测序技术）应用到由mRNA反转录而成的cDNA上, 从而获得来自不同基因的mRNA 片段在特定样本中的含量, 这就是mRNA 测序或 mRNA-Seq，同样原理, 各种类型的转录样本都可以用深度测序技术进行高通量检测, 统称作RNA-Seq。 RNA-Seq技术与其他转录组学技术比较 454测序技术 Solexa测序技术 SOLID技术 HeliScope测序技术 构建的单链DNA 文库未经扩增, 没有规律地排列在平面基板上。 每个测序循环中, DNA 聚合酶和4 种荧光标记的核苷酸中的一种流入, 按照模板序列延伸DNA 链, 阵列中发生了碱基延伸反应的DNA 链就会发出荧光, 并通过CCD 记录下来。 经过洗涤, 用化学物质将延伸了的DNA 链上的荧光物质被切除并被移走, 便可以进行下一轮单个碱基的延伸, 荧光标记的切除以及图像的获取。 几种高通量RNA-Seq技术对比 RNA-Seq 的应用 转录本结构研究 转录本结构变异研究 基因表达水平研究 非编码区域功能研究 低丰度全新转录本发现 RNA-Seq面临的问题及挑战 庞大的数据量所带来的信息学难题, 比如如何最好地诠释和比对鉴定多个类似的同源基因, 如何确定最佳测序量, 获得高质量的转录图谱等。 如何针对更复杂的转录组来识别和追踪所有基因中罕见RNA 亚型的表达变化。 有可能提前实现这一目标的将是使用配对末端测序和单分子测序等更新的测 序技术, 以及使用更长的读段来增加测序深度和覆盖度。 目前的高通量测序技术大都需要较多的样品起始量, 这使得来源极为有限的生物样品分析受到限制, 因此如何对单细胞或少量细胞进行转录组测序是一个亟待解决的问题。 谢谢