4-2 目的基因的获得.pdfVIP

第四部分 目的基因的获得 －目的基因的分离克隆及其方法 第四章 目的基因的获得 二.根据mRNA的特异性分离目的基因 （一）mRNA differential display PCR (DDRT PCR) 2 差式显示的基本策略是通过反转录与PCR扩增 mRNA 中特定的一小部分，用DNA序列分析胶（6 ％－8 ％）同步分离显示扩增产物以进行比较。 首先要以5’ －T （n ）MN—3‘ (3’ 固定引物．3’anchored Primer ，其中n ＝10一20 ，M ＝dA ／dC ／dG ，N ＝dA ／dC/dT ／ dG ） 作引物，将待比较的mRNA进行逆转录得到单链 cDNA ，由于该引物具有poly(dT ），故可与mRNA 的3’- poly(A)结合，而另外两个碱基MN的作用是使它定位在 poly(A)5‘端．并使它只介导约1 ／12的mRNA 的逆转录。 逆转录之后，以单链cDNA为模板，立即进行PCR ， 3’端引物就是上述3‘ 固