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护骨胶囊对成骨细胞增殖、分化影响 李宝红 吴劲东 赵文昌 宋丽军 (1.广东医学院药学院 广东 东莞523808广东医学院药理学教研室广东 东莞523808 摘要：目的：探讨护骨胶囊对体外培养的大鼠成骨细胞增殖、分化的影响。方法：采用多次酶消化法分离出大鼠颅盖骨的成骨细胞,采用MTT法和碱性磷酸酶法分别检测护骨胶囊对成骨细胞增殖和分化的作用;采用SYBR green I嵌合的RT-PCR方法检测Runx2 mRNA表达水平。结果：护骨胶囊在浓度0.025~2.5μg/mL对成骨细胞有促增殖的作用,护骨胶囊在浓度0.025~25μg/mL对碱性磷酸酶的活性均有提高的作用,护骨胶囊在浓度25μg/mL下,对Runx2 mRNA水平有上调的作用。结论：护骨胶囊对成骨细胞有促增殖、促分化的作用,可能与上调Runx2 mRNA水平有关。 ’s proliferation. The ALP activity was significantly increased at the concentration from 0.025μg/mL to 25μg/mL. With the concentration of 25μg/mL,Hugu Capsule can increase the Runx2 Mrna level.Conclusions:Hugu Capsule can stimulate the proliferation and differentiation of osteoblasts in vitro, and the reason may be connected with the up regulation of Runx2mRNA level. Key words:Hugu Capsule; osteoblasts; alkaline phosphate;Runx2 护骨胶囊是由淫羊藿、制何首乌、巴戟天、骨碎补、龟甲、山药、熟地黄、当归、杜仲、续断等组成的中药复方新药，临床试验表明其具有较好的治疗原发性骨质疏松症和绝经后骨质疏松症的作用[1-2]。但目前对其抗骨质疏松的作用机制尚未进行深入研究，本项目通过探讨护骨胶囊对大鼠原代成骨细胞增殖分化的影响，并进而分析其调控骨形成过程中转录因子Runx2 mRNA的表达水平，为护骨胶囊治疗骨质疏松症提供实验依据。 1 材料与方法 1.1 材料及试剂 护骨胶囊干膏粉，由东莞万成制药有限公司提供，临用前用DMEM配制成所需药物浓度；新生SPF级大鼠，1ｄ龄，购自广东医学院实验动物中心，动物合格证号：SYXK（粤）2008-0008；DMEM培养基，Gibco公司；胎牛血清，hyclone公司；碱性磷酸酶试剂盒，由南京建成生物工程研究所提供；逆转录试剂盒和real time-PCR试剂盒，由大连Takara公司提供；引物由上海生工生物工程有限公司设计并合成。 1.2 主要仪器 ABI 7500 Real Time PCR 扩增仪，美国ABI 公司；Nanodrop 1000 核酸蛋白微量定量仪，美国Nanodrop 公司；5417R型高速台式离心机，德国Eppendrorf 公司；微型离心机，德国Eppendorf 公司；PCR 扩增仪，美国Applied Biosystems 公司；酶标仪，美国BioTek 公司。 1.3 方法 1.3.1 成骨细胞的分离 取新生的SD大鼠约10只，脱臼处死后投入盛有75%乙醇的容器内消毒5min，取出置于消毒培养皿中。无菌条件下剪去头顶部皮肤，取出颅盖骨，然后放入盛有PBS缓冲液（含100U/mL青霉素和100mg/L链霉素）的培养皿中，清除骨膜、血管等结缔组织，用PBS缓冲清洗2次后将洗净的颅盖骨剪成1mn小片。移入0.25%胰蛋白酶溶液中，37℃下预消化20min，以消除纤维组织。消化6个循环，每个循环20min，前2次循环去掉沉淀，后4次循环取沉淀，1000r/min离心10min，细胞以适当的密度接种到培养瓶中，放入37℃，5%CO培养箱中培养，次日换液，以后每隔2d换液1次，待细胞融合80%左右后，用胰蛋白酶进行消化传代，本次实验所采用的是3代或4代细胞。每项实验重复3次。 1.3.2 成骨细胞鉴定 取3代或4代细胞，接种于6孔板中，待细胞生长贴壁后，去掉培养基，用4℃2.5%戊二醛冷固定10min，然后按照BCIP/NBT试剂盒进行染色操作，倒置显微镜下观察。 1.3.3 细胞增殖实验 取3代或4代成骨细胞，用0.25%胰酶消化制成细胞悬液，以每孔3×10/mL接种于96孔板中，每孔100μL，同时设置空白调零孔。细胞常规培养24h后，换入不同浓度的护骨胶囊溶液，于规定的时间点进行检测，加入不含血清的培养基100μ