新技术破解RNA测序的方方面面-生物探索.PDF

新技术：破解 RNA 测序的方方面面 自 2005 年以来，以 Roche 公司的 454 技术、Illumina 公司的 Solexa 技术和 ABI 公司的 SOLiD 技术为标志的新一代测序技术相继诞生，新一代测序技术又称作深度测序技 术，主要特点是测序通量高，测序时间和成本显著下降。把这种高通量测序技术应用到由 mRNA 逆转录生成的 cDNA 上，从而获得来自不同基因的 mRNA 片段在特定样本中的含量， 这就是 mRNA 测序或 mRNA-seq。 同样原理，各种类型的转录本都可以用深度测序技术进 行高通量定量检测，统称作 RNA-seq 或 RNA 测序。 随着新一代高通量 DNA 测序技术的快速发展，RNA 测序 (RNA-seq)已成为基因表达和 转录组分析新的重要手段，并且随着 RNA 的重要性逐渐被认识，研究人员也开发出多种方 法来研究它。 但是许多方法仍需将 RNA 反转录成 cDNA， 而这一步会引入错误， 且效率不高。 近期一些研究小组开发出了 RNA 测序新技术。 可消除转录组分析偏误的 RNA 测序技术 了解基因组的功能输出 （一个细胞或细胞群中的全部信使 RNA，被称为转录组），是生 物学研究过程中的一个必要步骤。当前研究转录组的方法依赖于微阵列和测序方法， 它们需 要合成互补 DNA，之后再进行多种操作，这样会引入偏误和潜在的人为结果。 研究人员利用单分子测序技术来进行 RNA 直接测序，这将有助于更为详细地了解有多 少基因组被转录、每个基因产生了多少 RNA 变异。这种转录组分析方法的局限是它需要成 百上千的细胞。 研究人员为了让 “边合成边测序”的反应适应直接的 RNA 测序，优化了使用的聚合酶 到缓冲液，并利用专门的荧光核苷酸类似物，从而能在 poly(dT)包被的表面捕获聚腺苷酸 化的 RNA，并利用大肠杆菌 poly(A)聚合酶 I 来进行边合成边测序的步骤。 首先研究人员对一段 40 个碱基的 RNA 序列进行测序，来检验这种方法。大约一半 （48.5%）的读长是 20 个核苷酸或更长。最长的无误差读数是 38 个碱基。随后他们将注 意力转向酿酒酵母这种模式生物。因为酿酒酵母的大部分 RNA 本身就存在聚腺苷酸化，所 以她们不需要在测序前再加上 poly-A 尾巴。 在这个实验中，研究小组产生了 41261 个读数，每个约为 20 个核苷酸或更长。近一 半（48.4%）的读数与酵母基因组配对。90%以上的配对读数是位于已知的酵母开放读码框 3’端的 400 个核苷酸内。实验过程中，研究人员意外地检测到酵母 RNA 3’端的异质性。 她们还发现证据，暗示至少有一些酵母核糖体 RNA 和小核仁 RNA （snoRNA）是聚腺苷酸化 的。 研究人员称这种 RNA 直接测序方法目前的错误率约为 4%，大部分是黑暗碱基（dark base）引起的缺失。插入的错误率为 1-2%，而替换的概率只有 0.1-0.3%。 高通量 RNA 测序 转录组提供了有关活性基因的功能、调控和互相依赖的信息。最近科学家们将高通量测 序仪应用于转录组分析 （RNA-Seq），新方法让研究人员能够更为详细地了解有多少基因组 被转录、每个基因产生了多少 RNA 变异。这种转录组分析方法的局限是它需要成百上千的 细胞。 研究人员将转录组分析方法应用到单个细胞的分析中， 并以前所未有的精度分析了取自 四细胞胚胎和卵母细胞的单个老鼠细胞的转录组。新方法不仅对发育生物学的研究至关重 要，而且也让科学家们能够在胚胎发育的早期深入研究单个细胞中全部基因表达、研究复杂 组织中的细胞异质性，并在单个细胞的水平上分析疾病的发展。 RNA 测序数据处理 RNA-seq 技术产生的海量数据为生物信息学带来了新的机遇和挑战， 有效地对测序数据 进行针对性的生物信息学处理和分析， 成为 RNA-seq 技术能否在科学探索中发挥重大作用 的关键。 很多 RNA-seq 实验的目的是为了比较两种或多种样本中基因表达或整个转录组的差 异，如比较癌症组织和正常组织的转录组差异等。这些差异既包括通常意义下的差异表达基 因，也主要包括选择性剪接模式的差异、剪接异构体表达的差异、非编码转录本的差异等。 这些差异一般可以用一些统计假设检验方法检测， 但这种检验有时会受到测序深度、 基因长 度等因素的影响，需要对结果进行仔细分析，消除可能的混杂因素，