荧光恒温扩增技术检测肠道病毒71型方法的建立与评价.pdfVIP

检验医学２０１４ 年１１ 月第２９ 卷第１１ 期　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ２０１４，Ｖｏｌ２９．Ｎｏ １１． ·１１１５ · 文章编号：１６７３８６４０（２０１４）１１１１１５０５　　　中图分类号：Ｒ４４６．１　　　文献标志码：Ａ　　ＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７３８６４０．２０１４．１１．００９ 荧光恒温扩增技术检测肠道病毒７１ 型方法的建立与评价 曹凌峰，　苏犁云，　董妞妞，　徐　锦 （复旦大学附属儿科医院临床检验中心，上海２０１１０２） 　　摘要：目的　利用荧光恒温扩增（ＳＡＴ）技术建立一种快速可靠的肠道病毒７１ 型（ＥＶ７１）检测方法。方法　 通过设计特异性的ＥＶ７１ ＲＮＡ扩增引物及优化探针技术，使用ＭＭＬＶ反转录酶及Ｔ７ ＲＮＡ多聚酶对ＥＶ７１ ＲＮＡ 进行核酸扩增，同时利用荧光定量聚合酶链反应（ＰＣＲ）仪进行实时的荧光信号收集和检测。检测复旦大学附属 儿科医院儿童手足口病患儿粪便样本１９９例，以ＥＶ７１ 型核酸检测试剂盒作参比方法，ＤＮＡ测序为第三方验证 方法，对研究数据进行Ｋａｐｐａ一致性分析。结果　ＳＡＴ技术共检测到１１９ 例ＥＶ７１ 阳性样本，其中２１ 例荧光探 针法检测为阴性，经测序证实２０例样本仍为阳性。ＳＡＴ与荧光探针法检测结果的Ｋａｐｐａ值为０．７８９。ＳＡＴ方法 的敏感性１００％、特异性９８．７７％。结论　本研究建立的ＥＶ７１ 型ＲＮＡ ＳＡＴ技术具有敏感性高、特异性强、准确、 快速可靠等优点，适用于临床对ＥＶ７１ 感染的快速诊断。 关键词：肠道病毒７１ 型；荧光恒温扩增技术；手足口病；敏感性；特异性 　　ＥｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔａｎｄｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｉｓｏｔｈｅｒｍａｌａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎａｓｓａｙｆｏｒｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＥｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ ７１　ＣＡＯＬｉｎｇｆｅｎｇ，ＳＵＬｉｙｕｎ，ＤＯＮＧ Ｎｉｕｎｉｕ，ＸＵＪｉｎ．　（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｃｈｉｌｄｒｅｎ′ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆＦｕｄａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ２０１１０２，Ｃｈｉｎａ） 　　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ａ ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｒｅｌｉａｂｌｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ （ＳＡＴ）ｆｏｒｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆＥｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ７１ （ＥＶ７１）．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｂｙ ｄｅｓｉｇｎｉｎｇ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒｓ ａｎｄ ｏｐｔｉｍａｌ ｐｒｏｂｅ ａｎｄ ｕｓｉｎｇ ＭＭＬＶ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ａｎｄ Ｔ７ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，ｔｈｅ ＳＡＴ ｗａｓ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ＥＶ７１ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ＲＮＡ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ （ＰＣＲ）．Ａ ｔｏｔａｌ ｏｆ １９９ ｓｔｏｏｌ ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｃｈｉｌｄｒｅｎ ｗｉｔｈ ｈａｎｄ，ｆｏｏｔ，ｍｏｕｔｈ ｄｉｓｅａｓｅ ｆｒｏｍ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ′ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｆｕｄａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ．Ｕｓｉｎｇ ＥＶ７１ ＰＣＲｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｋｉｔｓ ａｓ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｋｉｔ ａｎｄ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｓｔｈｅ ｔｈｉｒｄ ｐａｒｔｙ ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ，ｔｈｅＫａｐｐａ ａｎａｌｙｓｉｓ ｗａｓ ｐｅｒｆｏｒｍｅｄｏｎｔｈｅ ｓｔｕｄｙｄａｔａｆｏｒｃｏｎｓｉｓｔｅｎｃｙ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ａｔｏｔａｌｏｆ１１９ ｓｔｏｏｌ ｓｐｅｃｉｍｅｎｓｗｅｒｅｐｏｓｉｔｉｖｅｂｙＳＡＴ， ａｎｄ ｔｈｅｒｅ ｗｅｒｅ２１ ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ ｂｅｉｎｇ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｂｙ ＰＣＲｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｐｒｏｂｅ ａｓｓａｙ，ｂｕｔ ２０ ｓｐｅｃｉｍｅ