精品培训517.pptVIP

对激发光488的选色建议(4)---- 最常用的激发光 RPE-Alexa Fluor? 700 可以用于BD? FACSCalibur? 流式仪 能量转换染料激发光488nm，发射光小于723nm 在BD FACSCalibur? 和 BD FACScan?流式仪中的第三通道中被检测。t在第二和第四通道中补偿少。 和 RPE-Cy?5 (TRI-COLOR?, CyChrome, PC5), PerCP, 和 RPE-Cy?5.5两者择一使用 和 RPE-Alexa Fluor? 610染料合用,可以在488nm激发下实现同时使用四种颜色检测。 RPE-Cy?5.5 能量转移染料，激发光是488nm，发射光小于694nm Lower photostability than RPE-Alexa Fluor? 700？ 和APC同时使用时，补偿较多 在 BD FACScan? and BD FACSCalibur?流式仪的第三通道中被检测。 在Beckman Coulter EPICS? XL? 流式仪中的第四通道被检测 RPE-Cy?7 能量转换染料，最长激发光775nm，是488激发光中能够提供最长的发射光的染料。 可以通过调节RPE通道来检测 对激发光635的选色建议(1) APC（Allophycocyanin) 激发光635nm发射光660 亮度高 在第四通道可以被检测到 Alexa Fluor? 647 能量转换染料，激发光是633/635，发射光668nm 可以和 APC and Cy?5替换使用，在胞内染色的实验中背景更低 和APC具有同样的荧光亮度，但是比起APC和 Cy?5颜色更稳定。 对激发光635的选色建议(2) Alexa Fluor? 700 能量转换染料，激发光 633/635 nm，发射光 723 nm 在使用红色激光激发时，可以和APC（660），APC-Alexa Fluor? 750（775nm）三种染料共同使用 荧光强度非常强，荧光更稳定 和 APC-Cy?5.5可以互相替换，但是是一个简单的小分子 和APC补偿最小 和 RPE-Alexa Fluor? 700，RPE-Cy?5.5需要大量的补偿，不建议一起使用 APC-Alexa Fluor? 750 能量转换染料，激发光 633/635 nm发射光 775 nm 荧光强度比APC-Cy?7更好，荧光稳定性更强 和 APC成对使用时比 APC-Cy?7/APC组合补偿更少 和 APC-Cy?7可以替换使用 以最常用的BD Calibur为例 流式数据分析举例（1） 流式数据分析举例（2） 流式数据分析举例（3） 流式数据分析举例（3） 流式数据分析举例（4） 流式数据分析举例（5） 流式数据分析举例（6） 流式数据分析举例(7) 双染补偿实验（1） 除去双染所需要的样品外，需要准备单色样品作为补偿数据参照 以Alexa Fluor 488为例,在和R-PE配对的双染实验中，作为单色补偿样品 双染补偿实验（2） 所得到的图像不仅在AF488通道有信号，在R-PE通道也有等量的信号，那是因为前面所述的AF488在R-PE所用的585滤镜中也有重叠信号滤出 理想的图像是这样的，在横坐标AF488上有对应的阴性信号和阳性信号；在纵坐标R-PE上是全阴性信号，为了得到这个图我们要减去重叠到585R-PE滤镜中的信号 双染补偿实验（3） 没有减去AF488信号 减去10%AF488信号 减去20%AF488信号 减去30%AF488信号 常用的双染配对实验中的补偿（1） 常用的双染配对实验中的补偿（2） 常用的双染配对实验中的补偿（3） 常用的双染配对实验中的补偿（4） 常用的双染配对实验中的补偿（5） 三染介绍（1） 通常情况下，激发光和发射光之间至少要求100-150nm不同，R-PE的激发光是488nm或532nm。 所以采用488nm的激光作为R-PE染料的激发光，发射光575nm，两者还是比较接近 三染介绍（2） 为了拉开激发光和发射光之间的距离，科学家把染料AF700和R-PE偶联在一起。 R-PE被488nm激光激发后，发射光是575nm。这个发射光又激发了偶联的AF700染料，AF700的发射光是723nm。 FRET（Fluorescence resonance energy transfer） 三染介绍（3） 从这个图我们能看出两者发射光谱之间的距离 这里我们可以清楚地看到R-PE的激发光和AF700的发射光有很大的重叠 三染介绍（4） 激发光488nm我们可以通过使用偶联荧光蛋白的方法收集到较远发射光谱的AF700的发射光 这种方法的使用使三染实验成为可能 三染介绍（5