管理生物化学实验方法及常用仪器介绍.pptVIP

* 凝胶类层析介质的内部具有大孔网状结构 * 当分子大小不同的样品加到凝胶柱上洗脱时，大分子不能进入凝胶内部，而是沿凝胶颗粒间的空隙移动，阻碍较小，最先流出柱外，而小分子可以进入凝胶颗粒内部的多孔网状结构，洗脱收到阻碍，流速缓慢，以致最后流出柱外，从而使样品中分子大小不同的物质得到分离。 * 虹吸法的优点是不必穿刺离心管，离心管可反复使用。经多次试证实，此法简便易行，对梯度密度无破坏。 * 丙酮、汽油 * 在任何情况下，转子的工作转速都要低于或等于其最高转速。出现以下情况时，需适当降低最高使用转速。 首先，当离心管、管帽或套管材质更换成大密度材质时，应降低运转速度（低于最大速度）。 当离心管、管帽、套管都更换时，还要在单独降速的基础上再相应降低（使用时要查阅相应的转子说明书）。 * 式中，N最大为转子的最高转速（标在转子表面）；N实际为实际允许的转速；ρ为转子装入介质的平均密度；1.2为设计转子时规定的介质密度。 式中，157.6g指设计转子时规定的最大装样量；47500指该转子的最高转速。 * 因此精密地平衡离心管和它们的内容物是十分重要的. * 在平衡时不仅要保证静平衡，即对称的两管样品等重，还要保证动平衡。因为离心时产生的力矩不仅与样品的重量有关，还和样品的旋转半径有关。 例如一管水和半管砂子虽然重量相等，但半管砂子的旋转半径要大一些，所以力矩相差很大，转动起来并不平衡。所以处于对称位置的两个离心管必须装载密度相近的样品。 例如要同时离心两个样品，一管是用蒸馏水稀释的，另一管是用60%的蔗糖水溶液配制的。虽然两管重量相等，但不可配成一对离心，而必须另装一管水和一管60%的蔗糖水溶液作为平衡物分别配平。 * 平衡后的一对离心管及其内容物(有时还可能包括离心管套筒)应对称放置，不能错位，不能装载单数的管子，以免因离心所产生的离心力不对称而损坏离心轴。 * 高压匀浆法的适用范围较广，在微生物细胞和植物细胞的大规模处理中常采用 * 在超声波作用下液体发生空化作用，形成一个个密集的小气泡，这些小气泡迅速炸裂，产生的象小炸弹一样的能量，从而起到破碎细胞等物质的作用。 * 超声波细胞破碎仪由超声波发生器和换能器组成。 超声波发生器将50Hz220V市电变成20KHz电能供给换能器。换能器随之做纵向机械振动。振动波通过浸入在生物溶液中的钛合金变幅杆产生空化效应，激发介质里的生物微粒剧烈震动，引起的冲击波和剪切力使细胞破碎。 * Triton X-100是一种非离子型表面活性剂（或称清洁剂），分子量为646.86（C34H62O11）。它能溶解脂质，以增加抗体对细胞膜的通透性。 * 自溶作用是酶解的另一种方法，利用生物体自身产生的酶来溶胞，而不需外加其他的酶。 * 每种细胞破碎技术都有不足和应用的局限性。如球磨法、高压匀浆法等，虽然破碎效率高、成本低，操作简便，但因细胞破碎度高，胞内物质全部释放，大量的杂蛋白和核酸的释放使破碎物粘度很高，给后续的固-液分离带来困难，给产物分离纯化增加了负担；机械破碎剪切力高，会释放大量的热，易造成敏感的生物活性物质失活。所以我们一般采用多种破碎方法相结合的手段。 * 这里的上游是指菌种选育，基因工程菌构建，细胞培养和发酵过程。 * 细胞破碎之后，需将细胞碎片和未破碎的细胞去除，将溶在溶液中的产物回收。因细胞破碎后，大量的蛋白质和核酸释放出来，与粒度很小的细胞碎片一起，使悬浮液变得很粘稠，无论采用哪种固-液分离技术都十分困难，针对这一问题提出了一些方法。 将细胞破碎和双水相萃取融合，即在细胞破碎前制备细胞悬浮液时，按双水相组成的要求加入PEG和其它成相组分，利用球磨或其他方法进行细胞破碎。破碎物通过静止或低速离心，分相，回收含有目的产物的上相，弃去含未破碎细胞和细胞碎片的下相，既达到了产物的回收，又进行了初分离的目的。由于PEG的保护作用，即使细胞破碎时温度较高，也可获得较高的目的产物回收率。 * 层析技术也称色谱技术，是一种重要的生物大分子分离纯化技术，在当今的生物化学和分子生物学领域有非常广泛的应用。 * 层析分离技术因其操作简便，不需要很复杂的设备，样品用量可大可小，故既可用于实验室的分离分析，又适用于工业生产中产品的分离制备。它与光学仪器配合，可组成各种自动化分离分析仪器，进一步显示了层析分离技术的优越性。在生化技术领域里，层析技术已成为一项最常用的分离分析方法。此项技术可用于研究物质组成和分离纯化各种成分。通常用于分离分析氨基酸、核苷酸、糖类、激素、维生素等成分。其优点是能够分离与分析在组成、结构及性质上极为相似的物质，设备简单，操作容易，样品用量少，结果较准确。 * 在层析法发现之前，物质的分离和纯化几乎都是根据其挥发度、溶解度的不同，用分馏、沉淀、升华和重结晶等方法