实验三：菌种保存及细菌形态观察.pptVIP

菌种保存及细菌形态观察 2010.10 ~ 2010.12 实验目的 1.了解简单染色法和革兰氏染色法的原理，掌握具体操作方法 2.了解细菌芽孢染色法的原理，掌握具体操作方法 3.学习并掌握微生物涂片、染色的基本技术和无菌操作技术 4.学习油镜的使用方法 5.初步认识细菌的宏观和个体特征 实验原理 微生物培养技术 斜面接种 液体培养基接种 穿刺接种 形态观察主要包括群体的形态和个体的形态观察。 细菌的基本形态主要分为球菌、杆菌、螺旋菌三大类，近年还发现星状和四方形细菌等。细菌形态受培养时间、培养基成分、浓度、培养温度、培养时间等发生变化。 细菌菌落大多表面光滑湿润，有光泽，一般菌落较小，质地颜色均匀，同培养基结合不紧密。 细菌个体微小，较透明，必须染色方可呈现。根据细菌个体形态观察的不同要求，可将染色分为3种类型：简单染色、鉴别染色、特殊染色。 简单染色是利用单一染料对细菌进行染色。细菌在中性、碱性或弱酸性溶液环境中通常带负电荷，碱性染料（解离时分子的染色部分带正电荷）如美兰、结晶紫等易与细菌结合使其着色。 芽孢壁比营养细胞的细胞壁结构复杂而且致密，透性低，着色和脱色较营养细胞难。用着色力强的碱性染料在微火上加热，或延长染色时间，使菌体和芽孢同时染色后，用蒸馏水冲洗，脱去菌体颜色，保留芽孢的颜色。并用另一种对比鲜明的染料使菌体着色。 5.油镜观察 油浸物镜的工作距离很短，一般在O.2 mm以内，因此使用油浸物镜时要特别细心，避免由于“调焦”不慎而压碎标本片并使物镜受损。 (1)先用40倍镜观察标本，找到要观察的标本结构放入视野中央，然后用粗调旋钮下降载物台约2cm，并将高倍镜转出。 (2)在玻片标本的镜检部位滴上一滴香柏油。 (3)从侧面注视，用粗调节旋钮将载物台缓缓地上升，使油浸物镜浸入香柏油中，使镜头几乎与标本接触。 (4)目镜观察，放大视场光阑及虹彩光圈，使光线充分照明。用粗调节旋钮将载物台徐徐下降，当出现物像一闪后改用细调节旋钮调至最清晰为止。如油镜已离开油面而仍未见到物像，必须再从侧面观察，重复上述操作。 (5)观察完毕，下降载物台，将油镜头转出，先用擦镜纸擦去镜头上的油，再用擦镜纸蘸少许乙醚乙醇体积2：3的混合液，擦去镜头上残留油迹，最后再用擦镜纸擦拭2-3下即可(注意朝一个方向擦拭)。 试剂与器材 1、材料 金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、四联球菌、枯草芽孢杆菌（培养12h-18h）、酵母菌 2、试剂 吕氏碱性美蓝染液（或草酸铵结晶紫染液）、齐氏石炭酸复红染液、革兰氏染色液（结晶紫液、碘液、95％乙醇、番红液）、5％孔雀绿水溶液、0.5％番红水溶液 3、器材 显微镜、酒精灯、载玻片、盖玻片、双层瓶（内装香柏油及二甲苯）、擦镜纸、生理盐水、滤纸等。 实验内容 一.菌种保存 二.简单染色法 三.革兰氏染色法 四.芽孢染色法 菌种保存 a.斜面接种：由已长好微生物的斜面中挑取少量菌种接种至另一空白斜面培养基上。 配制牛肉膏蛋白胨培养基每班配制500ml，每组分装2支试管，摆斜面。 1.接种前用记号笔在距试管口2－3cm位置上，注明菌名、接种日期等。 2.将试管放于手掌中，并用手指夹住，使两支试管呈“V”字形。 3.用火焰将接种环烧红，然后将接种环来回通过火焰数次。 4.用小指、无名指和手掌拔下试管塞，并持于手中。 5.将试管口在火焰上微烧一周。 6.将烧过的接种环伸入菌种管内，先将环接触一下没有长菌的培养基部分，使其冷却， 以免烫死菌体，然后用环在菌苔上轻轻地接触，刮下少许培养物，并将接种环慢慢的从试管中抽出，并迅速地伸入另一试管中，在斜面上划线（波浪或直线），使菌体沾附在培养基上。 7.将接种环抽出，灼烧管口。 8.塞上棉塞。 9.将接种环经火焰灼烧灭菌。 b.液体培养基接种 配制马丁氏培养基，每班配制1000ml，每组分装至50ml锥形瓶中（约25ml）1支，包扎，灭菌。 需准备以下物品： 移液管 1支 接种操作：吸取酵母菌液0.5ml加入至培养基中，缓慢摇匀，包扎，摇床培养，下次试验使用。 细菌形态观察 一、简单染色实验步骤 1、涂片—金黄色葡萄球菌 2、干燥：室温自然干燥 3、固定：通过火焰2－3次，细胞质凝固 4、染色：滴加染液 5、冲洗：水洗至无色 6、干燥：自然，吹干，吸干 7、镜检. 二、革兰氏染色法 1.制片：取菌种培养液（大肠杆菌、金黄色葡萄球菌）常规涂片，干燥，固定（涂片不宜过厚；火焰固定不宜过热） 2.初染：滴加结晶紫，染色1－2min，水洗 3.媒染：用碘液冲去残水，并用碘液覆盖约1min，水洗 4.乙醇脱色：滤纸吸去残水，倾斜玻片用95％乙醇洗涤