生物技术综合实验方法2012.docVIP

生物技术综合实验 甘薯海藻糖-6-磷酸合成酶(trehalose-6-phosphatesynthase, TPS)1．材料 1.1 薯材、菌株、质粒 甘薯（Ipomoea batatas Lam）品种为徐薯18（本实验室品种），E.coli BL21(DE3)，E.coli JM109 原核表达载体使用pET32a（+）（本实验室保存）。 1.2 主要试剂和工具酶 RNA提取试剂盒购自Invitrogen，胶回收试剂盒购自Axgen公司，M-MLV逆转录酶购自Invitrogen，RNase inhibitor购自Fermentas，KOD-Plus-Neo酶购自日本东洋纺公司，引物由Invitrogen 以及华大基因公司合成，测序由华大基因公司进行。 μL氯仿，用手剧烈振荡混匀后室温放置3-5 min使其自然分相； 4. 4 °C 12,000 rpm离心15 min，吸取上层水相转移到新管中；在上清中加入等体积冰冷的异丙醇，室温放置15 min； 5. 4 °C 12,000 rpm离心10 min，弃上清，RNA沉淀于管底； 6. RNA沉淀中加入1 mL 75%的乙醇（用RNase-free水配制），温和震荡离心管，悬浮沉淀；4 °C 8,000 rpm离心2 min，弃上清； 7. 室温放置10 min晾干沉淀； 8. 沉淀中加入50-100 μL RNase-free ddH2O，轻弹管壁，以充分溶解RNA，-70 °C保存。 9. 用1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，跑胶过程中加入Goldview。 实验二 第1链cDNA的合成和模板的验证 1. 在RNase free Microtube 管中配制下列混合液： dNTP mixture（10 mM each） 1 μL *Oligo (dT) Primer (10 μM) 4 μL Total RNA 2 μL RNase free ddH2O up to 12 μL 2. 将混合物65 °C加热5 min，迅速在冰上冷却2 min，快速离心，然后加入下列成分： 5×First-strand Buffer 4 μL 0.1 M DTT 2 μL Ribonuclease Inhibitor (40 U/μL) 1 μL 3. 将混合物轻轻混匀，37 °C温浴2 min。 4. 加入M-MLV反转录酶（200U/μL）1 μL，用枪头轻轻吹打混匀。 5. 37 °C温浴50 min。 6. 70 °C加热15 min，使反转录酶失活。所得反转录产物可直接用于PCR反应。 反转录模板的看家基因的验证（β-actin） 引物 primers sequences Size IbActinF IbActinR 5-TTCCCCGGTATTGCGGATAGAATG-3 5-CGGACCGGACT CATCATACTCTG -3’ 198bp 以第一链cDNA为模板，β-actin-F和β-actin-R为引物，使用酶进行PCR表1 β-actin PCRμL体系）） DNA模板 1μL(约50 ng) ×PCR缓冲液(Mg2+ plus) μL Mg2+ 2.5μL 10 mol/L TPS -F 1 μL 10 mol/L TPS -R 1μL 2.5 mmol/L dNTP 2.5μL Taq 酶 0.2 μL 灭菌去离子水 μL 合计 25 μL 2.2. PCR反应条件 94℃ 2min 98℃ 10sec 54℃ 30sec 30个循环 68℃ 3min 68℃ 6min 1%琼脂糖凝胶上电泳检测扩增产物，并进行胶回收纯化。TPS基因克隆 primers sequences Size TPS-F TPS-R 5-GA