石榴根际土壤细菌的分子鉴定及其对石榴枯萎病菌的抑制作用.docVIP

石榴根际土壤细菌的分子鉴定及其对石榴枯萎病菌的抑制作用 摘 要 通过研究石榴病株的根际土壤细菌的生物学特性，分子鉴定，探索不同菌株对石榴枯萎病菌生长的影响，寻找有效的生防菌株，为石榴枯萎病的防治提供新的有效途径。提取根际土壤中分离得到12种不同细菌菌株的DNA，利用其r DNA ITS 区段进行16S RNA PCR扩增进行分子鉴定；对云南省蒙自市新安所镇石榴枯萎病病枝进行分离纯化得到单一的石榴枯萎病菌，并观察其在12种土壤细菌菌液抹匀的PDA上的生长情况。结果表明，编号为PSBS001,PSBS003,PSBS008,PSBS009,PSBS011的土壤细菌和枯草芽孢杆菌的同源性高达98%，初步鉴定为芽孢杆菌属（Bacillus subtilis），并对石榴枯萎病菌有较好抑制作用。 关键词：石榴枯萎病；枯草芽孢杆菌；土壤细菌；分子鉴定；抑制。 石榴根际土壤细菌的分子鉴定及其对石榴枯萎病菌的抑制作用 1 引言 石榴,别称安石榴。为石榴科木本植物。石榴是云南省蒙自最著名的特色水果，栽培石榴历史已有七百余年，以前仅在房前屋后零星种植，1987年引入世界银行贷款后，蒙自县开始发展石榴。通过政策引导、资金扶持、技术研发与指导、基础设施建设以及市场开拓，到2007年石榴种植面积发展到11.19万亩，投产面积7.29万亩，实现产量9.5万吨，产值2.65亿元。2008年新植2500亩，全县面积发展到11.44万亩，投产面积8.3万亩，预计产量10.8万吨，产值3.2亿元。石榴是蒙自一种重要的经济果树[1]，蒙自县新安所镇产的甜石榴果实具有色泽艳丽，粒大皮薄，肉厚核软，汁多味甜等特点,是我国石榴中难得的佳品。蒙自石榴还具有萌芽开花一早、 果实成熟早的优势。 蒙自甜石榴以其独特的品位在我国石榴市场上占有绝对优势地位，每年农历七月至九月是蒙自石榴鲜果成熟上市的最佳季节，产品远销国内28个省(市、区)及越 南、俄罗斯等6个周边国家。石榴还有广谱抗菌的作用,石榴皮中含有多种生物碱，其对金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌、霍乱弧菌、痢疾杆菌等有明显的抑制作用，其中对志贺氏痢疾杆菌作用最强，石榴皮水浸剂在试管内对各种皮肤真菌也有不同程度的抑制作用，具有很高的经济价值[2]。随着石榴种植规模的逐渐扩大，石榴病害日益严重。石榴上常见的病害有石榴果腐病[3]，石榴干腐病[4]，石榴褐斑病[5]等。近年来，由甘薯长喙壳引起的石榴枯萎病相继在印度、中国出现，并在短期内造成石榴植株大片枯死，严重影响了石榴的生产和发展，造成了巨大的经济损失。根据甘薯长喙壳菌目前国内外的研究概况，从石榴生产的实际出发，采集云南省蒙自市新安所镇的发病石榴的枯萎病标样，进行分离培养，鉴定；并对石榴枯萎病根际土壤细菌进行分离、纯化，得到不同的细菌菌株，提取DNA，采用16s RNA 通用引进行PCR扩增,再进行测序，到NCBI网站进行比对，最后确定为何种细菌；本研究旨在探索石榴根际土壤细菌的分离和形态分子鉴定及其病原菌在不同菌株菌液环境和不同菌株菌液的不同浓度下的生长特性，寻找有效的生防菌株，为该病菌的防治提供新的有效途径。 目前，随着石榴种植规模的不断扩大，石榴枯萎病影响了石榴的生产，造成石榴生产的经济损失。甘薯长喙壳 Ceratocystis fimbriata Ellis. et Halsted引起的石榴枯萎病1990年首次在印度的Bijipur地区发生，至1993年已蔓延整个Karnataka地区。石榴园中病株年平均死亡率达7.5% 。2001年在云南省蒙自县相继发生石榴枯萎病，经作者分离鉴定以及致病性测定，证明病害是由甘薯长喙壳引起的，为国内果树新病害。Xyleborus fornicatus可Y. M. Somasekhara.报道了石榴枯萎病[9]；2000年，发现石榴枯萎病蔓延的比较快，同年他报道该病可能会影响到石榴种植业的发展；2002年研究发现枯草芽孢杆菌对石榴枯萎病菌有抵制效果，但未在田间大规模应用；2006年，筛选出了对石榴枯萎病有较高抗性的石榴品种，同年，报道了在马哈拉施特拉邦、卡纳塔卡、安得拉三个邦都有石榴枯萎病发现，发病率从0.74－8.14%不等；其间相继报道了石榴园常用除草剂对石榴枯萎病菌的影响[10][11]，草甘膦、乙氧氟草醚和百草对石榴枯萎病菌有较强的抑制作用。2011年，汤东生[12-16]等报道了杂草协调枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 对石榴枯萎病菌有一定抑制作用。但其生防菌株也不是来自当地，因而从当地病土中分离得到的不同细菌菌株，利用菌液提取DNA，再把产物进行PCR，进行分子鉴定；以云南省蒙自市新安所镇石榴枯萎病病枝进行分离纯化得到单一的石榴枯萎病菌，观察石榴枯萎病菌在不同菌株的菌液抹匀的PDA上的生长情况，以期得更好的结果。