g-氨基丁酸和谷氨酸含量.docVIP

ISSN 1009-3079 CN 14-1260/R 世界华人消化杂志 2004年 5月15日;12(5):1210-1213 高效液相色谱法测定人胃黏膜中(-氨基丁酸和谷氨酸含量 朱人敏, 秦苏堤, 何小平, 汪芳裕, 李 宁, 刘福坤 朱人敏, 秦苏堤, 何小平, 汪芳裕, 南京军区南京总医院消化内科江苏省南京市 210002李宁, 刘福坤, 南京军区南京总医院普通外科 江苏省南京市 210002项目负责人: 朱人敏, 210002, 江苏省南京市中山东路305号, 南京军区南京总医院消化内科. wangf65@电话: 025收稿日期: 2003-11-13 接受日期: 2004-02-01摘要 目的: 建立一种可同时测定胃黏膜组织微量(-氨基丁酸(GABA)和谷氨酸(Glu)含量的高效液相色谱法.方法: 用异硫氰酸苯酯(PITC)作衍生剂，色谱柱为Pico/Tag(氨基酸专用柱，梯度洗脱，紫外检测波长 254 nm..结果: GABA在0.125-6.25 nmoL/mL 范围，Glu在 0.025-2.5 (mol/mL范围，线性关系良好; GABA和Glu加样回收率分别为90.4-104%，88.1-105.5%; 批内误差分别为3.56%，和1.12%; 批间误差分别7.47%和5.98%.结论: 本法稳定、灵敏，可用于胃黏膜组织GABA和Glu含量的检测.朱人敏, 秦苏堤, 何小平, 汪芳裕, 李宁, 刘福坤. 高效液相色谱法测定人胃黏膜中(-氨基丁酸和谷氨酸含量. 世界华人消化杂志 2004;12(5):1210-1213/1009-3079/12/1210.asp0 引言(-氨基丁酸((-aminobutyric acid，GABA)主要来源于三羧酸循环中的谷氨酸(Glu)，是一种重要的抑制性神经递质，广泛存在于脊椎动物脑内，外周组织中含量很低[1-3]. 近年来研究表明: GABA除了作为胃肠神经递质，还有可能作为一种胃肠激素[4]，协同Glu，参与胃肠黏膜细胞分裂、分化、成熟的调节[5]，抑制胃癌的发生[4]. 随着GABA、Glu与胃癌关系研究的不断深入，要求建立一种快速、精确定量胃黏膜组织GABA、Glu含量的方法. 国外已有文献报道，应用荧光分光光度法测定人胃黏膜组织GABA含量，但灵敏度较低，干扰因素较多[5]. 本文首次采用异硫氰酸苯酯(PITC) 柱前衍生，高效液相色谱(HPLC)-紫外检测法测定胃黏膜组织GABA 、Glu 含量. 国内外未见此类报道. 该法的优点是PITC与氨基酸反应生成能在254 nm下检测的PITC-氨基酸[6-11]，分析速度快，灵敏度高，结果令人满意.1 材料和方法1.1 材料 Waters高效液相色谱仪系统(美国Waters公司)，其中包括510泵两台，486紫外检测器，自动梯度控制器，控温仪及柱温箱; Pico/TagTM工作台; 7 725 i进样阀(美国Rheodyne 公司); 色谱工作站(杭州英谱公司).(-氨基丁酸和谷氨酸: 美国Sigma公司; 衍生剂异硫氰酸苯酯(PITC): 美国Pierce公司; 乙腈、甲醇均为色谱纯: 德国Merck公司; 乙酸钠为分析纯: 英国普尔BDH化学公司; 其余试剂均为市售分析纯试剂，水为重蒸馏水.1.2 方法1.2.1 色谱条件 色谱条件 色谱柱: Pico/Tag(氨基酸专用柱3.9 mm ×300 mm; 流动相: 流动相A为乙腈:70 mmoL/L-1醋酸缓冲液(pH 6.5) =25:975，含0.25 mL/L-1的10 mmoL/L-1 EDTA; 流动相B为乙腈:水:甲醇=450:400:150.梯度洗脱条件如表1. 紫外检测波长254 nm; 柱温 45 °C; 进样量 20 (L.表1 梯度洗脱程序表 时间(min) 流动相(mL/min-1) A% B% 曲线 起始 1.00 100 0 - 13.50 1.00 97 3 11 20.00 1.00 96 4 8 20.50 1.00 20 80 5 22.50 1.00 0 100 6 23.00 1.00 100 0 6 30.00 1.00 100 0 6 1.2.2 溶液配制 样品稀释液: 5 (moL/L-1的Na2HPO4缓冲溶液，pH 7.4. 样品干燥液: 甲醇:1.0 moL/L-1醋酸钠:三乙胺 = 2/2/1(v/v/v). 衍生化试剂: 异硫氰酸苯酯(PITC):甲醇:乙醇:三乙