五叶草莓超低温保存和遗传稳定性研究.docVIP

五叶草莓超低温保存和遗传稳定性研究 　　摘 要：【目的】为了找出野生种质资源五叶草莓（Fragaria pentapylla）的超低温保存方法和分析超低温保存后五叶草莓的遗传信息稳定性，【方法】运用玻璃化法对五叶草莓离体茎尖超低温保存技术进行了研究，并采用AFLP和MSAP技术对其遗传稳定性作了探讨。【结果】结果表明，不同的低温锻炼时间、预培养时间、预处理时间、玻璃化溶液（PVS2）处理时间和液氮保存时间对五叶草莓超低温保存后成活率的影响各不相同，经优化后，低温锻炼3周，预培养3 d，预处理30 min，PVS2处理60 min时，超低温保存的最高成活率可达79.7%，液氮处理时间对成活率影响不明显；运用AFLP技术对超低温后成活生长120 d的材料及对照材料基因组DNA进行了分析，超低温前后带型一致，未发现明显差异片段；进一步用MSAP技术分析了超低温保存后成活的材料和对照材料DNA甲基化水平差异，结果表明超低温保存后五叶草莓DNA甲基化与去甲基化分别为5.70%和12.43%。【结论】玻璃化法超低温保存技术可以有效的保存五叶草莓种质资源，超低保存前后的五叶草莓基因组DNA没有发生多态性变化，但DNA甲基化水平降低。 关键词： 五叶草莓； 超低温保存； 玻璃化法； 遗传稳定性； 甲基化 中图分类号：S668.4 文献标志码：A 文章编号：1009-9980？穴2013？雪01-0055-07 栽培种凤梨草莓（Fragaria ananassa Duch.）是一种营养价值与经济价值较高的园艺作物，目前被视为一种经济植物而被广泛栽培[1]。由于野生草莓具有广泛的适应性和多种优良特性，例如：风味品质、抗病、抗虫和抗不良环境胁迫等，通常作为栽培种草莓改良的重要材料[1-3]。五叶草莓（Fragaria pentapylla），也叫泡儿，秧泡儿，原产我国，是我国丰富的野生草莓资源的一种[4]，它具有抗寒、抗病性强、果实香味浓等特点，是进行栽培种培育和改良的理想亲本。同时，五叶草莓属于二倍体草莓，染色体数目少[5]，基因组小得多，使其成为蔷薇科植物基因功能研究中有应用潜力的良好材料。五叶草莓以及野生草莓都是宝贵的野生资源，然而目前没有一种有效的手段使其种质资源得到长期保存。 上世纪70—80年代建立起的超低温保存技术对种质资源保存具有重要的意义[6-7]。超低温保存技术是将植物材料保存在-80 ℃及其以下，使细胞内的物质代谢与生长活动近乎停止，处于“生机停顿”（suspended animation）状态，从而实现植物材料的长期保存。目前，进行超低温保存的方法有多种[6-7]，主要是玻璃化法、包埋干燥法、包埋玻璃化法、小滴玻璃化法等。然而，植物在超低温保存过程中，会涉及到一系列的胁迫[8]，这些胁迫有可能对其遗传的稳定性产生一定的影响。近年来，许多学者就超低温保存后再生材料的遗传稳定性问题做了大量的研究和分析，主要集中在：（1）超低温保存材料的基因组遗传稳定性研究；（2）超低温保存再生材料的表观遗传信息变异情况分析等方面[8]。在基因组稳定性方面，许多学者运用了AFLP[9]、RAPD等多种技术对材料的基因组进行了分析，袋鼠花（Anigozanthos viridis）[10]、苹果[11]、拟南芥[12]、椰子（Cocos nucifera L.）[13]等大部分研究都证明了超低温之后基因组没有发生改变，但是在冷杉[14]、木瓜[14-15]等少数研究中却发现其基因组改变的现象。对超低温保存中的DNA甲基化变化的研究中，发现苹果[10]、木瓜[15]、蛇麻草（Humulus lupulus）[16]、拟南芥[17]、虎耳草科酷栗属[18]等不同基因型的植物材料经过超低温保存后甲基化水平均发生了不同程度的变化。我们采用玻璃化法对五叶草莓进行了超低温保存，运用AFLP技术对超低温保存前后五叶草莓材料的基因组信息进行分析，以确定五叶草莓材料超低温保存后基因组遗传稳定性是否良好，同时运用MSAP技术对超低温前后的五叶草莓的DNA甲基化水平进行分析，探讨五叶草莓超低温前后的甲基化水平变化以及变化趋势，以期为完善超低温保存后五叶草莓的研究提供参考。 1 材料和方法 1.1 材料 以河南大学植物种质资源及遗传实验室提供的五叶草莓 （F. pentapylla） 幼苗为实验材料，五叶草莓采自秦岭地区。 1.2实验方法 1.2.1 组织培养体系的建立 自田间选取五叶草莓健壮的匍匐茎，取1.5～3.0 cm长的顶芽，采用常规方法进行清洗和消毒，选用MS+6-BA 1.0 mg·L-1 +IBA 0.1 mg·L-1作为五叶草莓诱导培养基，MS+6-BA 0.5 mg·L-1 +IBA 0.1 mg·L