利用2b-rad测序结合hrm分析技术开发与梨矮生性状相关的dna.pdfVIP

中国农业科学 2017,50(15):3006-3012 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2017.15.014 利用2b-RAD测序结合HRM分析技术开发与 梨矮生性状相关的DNA分子标记 肖玉雄，王彩虹，田义轲，杨绍兰，李鼎立，张海月 （青岛农业大学园艺学院/青岛市园艺植物遗传改良与育种重点实验室，山东青岛 266109 ） 摘要：【目的】果树的矮生性状是一种重要的农艺性状，对果树的集约化栽培具有重要意义。来自西洋梨实 生变异品种‘Le Nain Vert’的矮生性状受控于一个单显性基因 PcDw，目前关于该基因的序列信息等还不清楚。 本研究的目的是开发与其紧密连锁的 DNA 分子标记，为鉴定该基因提供依据。【方法】根据分离群体分组分析的 原理，以‘矮生梨’ב茌梨’和‘2-3’ב绿宝石’2 个 F1 杂交分离群体为试材，应用 IIB 型限制性内切酶 的 RAD 技术（Restriction association site DNA，2b-RAD）对 2 对矮生型/普通型对比基因池进行基因组测序 分析，在对比基因池间筛选出单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphism，SNP）位点，从中筛查出位 于 PcDw 定位染色体上的 SNPs，用高分辨率熔解曲线分析技术（High-resolution melting analysis，HRM）在 群体上进一步检测验证，以确定其与 PcDw 位点的连锁关系。【结果】对 4 个样本（即 4 个对比基因池）的 2b-RAD 标签测序文库的测序结果共产生 67 186 260 条 reads，平均每个样本测序 reads 数为 16 796 565。将原始 reads 进行质量过滤后的统计结果表明，每个样本获得平均 unique 标签数目为 86 810，平均测序深度为 77×，该测序 深度能够达到准确分型的标准。SOAP 软件定位结果表明，4 个测序文库中含有酶切位点的高质量 reads 占测序 原始 reads 的 70%以上，表明测序质量较好。在来自 2 个不同群体的矮生型基因池与普通型基因池间进行对比 分析，初步筛选出 SNP 位点 1 317 个，其中有 8 个位于 PcDw 的定位染色体 scaffold00074 上。用 HRM 技术对这 8 个 SNP 标记在群体上的进一步检测结果表明，在‘矮生梨’ב茌梨’群体上有 2 个 SNP 标记、在‘2-3’× ‘绿宝石’群体上有 4 个 SNP 标记表现出与 PcDw 位点共分离的特性，根据其扩增子的熔解曲线形状差异，可有 效区分矮生型和普通型表型。在来自‘矮生梨’ב茌梨’群体的 215 个杂种后代和来自‘2-3’ב绿宝石’ 群体的 168 个杂种后代中，未发现有标记与性状的重组类型。【结论】2b-RAD 测序技术与 HRM 分析技术相结合， 进行果树重要农艺性状分子标记的开发，是一种行之有效的方法。基于这一策略，本研究鉴定获得了 4 个与西 洋梨矮生性状单显性基因 PcDw 连锁的 SNP 标记。 关键词：梨；矮生性状；PcDw；SNP标记；2b-RAD；HRM Development of DNA Molecular Markers for the Dwarf Trait in Pear Through the Method of 2b-RAD Sequencing and HRM Analysis XIAO YuXiong, WANG CaiHong, TIAN YiKe, YANG ShaoLan, LI DingLi, ZHANG HaiYue (College of Horticulture, Qingdao Agricultural University/Qingdao Key Laboratory of Genetic Improvement and Breedin