环境微生物的分离和分离纯化和鉴定.ppt

环境中微生物的分离、纯化及鉴定 实验目的 掌握利用平板分离法从环境中分离微生物的基本操作; 学习微生物的分类鉴定技术 实验材料和方法 以分离有机磷农药降解菌株为例： 实验材料: 菌源:长期受有机磷农药污染的土壤 培养基: 基础盐培养基：磷酸氢二钾1.0 g，磷酸二氢钾0.3 g，硫酸镁0.1 g，硫酸亚铁 0.1g， 氯化钠1.0 g， 去离子水1000 ml ，pH 7.0。 降解菌株的富集、培养 取长期施用有机磷农药的污染土壤10.0克，置于100 mL富集培养基（以100 mg/L有机磷农药为唯一碳源的基础盐培养基 ）中，于30℃，120 rpm摇床培养1d。 取适量菌液接入同样培养基中，30℃培养，反复转接。 培养 将细菌培养基倒置于30 oC培养箱中培养1-2d; 挑菌（纯化） 挑取能在有机磷农药的平板上产生水解圈的菌落。 纯化分离 将单菌落于平板上多次划线分离，只至菌体形态单一，大小一致（也可以用显微镜涂片染色镜检是否是单一的微生物）. 如有杂菌需进一步纯化、分离。 鉴定 1. 生理生化、形态学鉴定(略) 2.16S rRNA基因序列分析 生理生化鉴定 V.P.反应 (葡萄糖蛋白胨水培养基) （蛋白胨5g，K2HPO4 2g， 葡萄糖 5g，水1000 ml，pH7.6 121/30 min灭菌） 利用葡萄糖氧化、发酵产酸（商品化的糖发酵管） 吲哚试验（蛋白胨水培养基） （蛋白胨10g，NaCl 5g，水1000ml，pH7.6 121/30min灭菌） 水解淀粉（淀粉平板）（蛋白胨10g，牛肉膏 5g， NaCl 5g，可溶性淀粉2g，水1000ml，琼脂 18g， pH7.2 121/30min灭菌） 需氧情况： 最适pH： 最适温度： 注：+， 阳性反应； -， 阴性反应 V.P试剂、吲哚试剂、卢戈氏碘液(淀粉水解试验) 16S rRNA基因序列分析 菌体总DNA的提取 采取SDS高盐沉淀法。菌株活化后接5mL试管，于30℃剧烈振荡培养过夜，10%接种量转接至50 mL LB液体培养基培养至稳定期。 离心收集菌体，等体积TEN洗涤菌体，离心收集菌体，悬浮于10 mL TEN中，加入200μL溶菌酶（100 mg/mL），37℃水浴1h，加入50μL蛋白酶K（19 mg/mL），再加入500μL 20%的SDS，37℃水浴过夜。加入1/3体积饱和NaCl剧烈振荡，12000 rpm离心5min，上清用等体积酚：氯仿抽提2次，12000 rpm离心5min，收集上清，加入等体积TE，0.6倍体积异丙醇沉淀，挑取线状沉淀，70%乙醇洗涤沉淀，乙醇挥发后溶于200μL TE中。 16S rRNA基因的PCR扩增 引物为5-agagtttgatcctggctcag-3（E.coli 8 to 27）和5-taccttgttacgactt-3（E. coli 1507 to 1492）。 16S rRNA gene序列 AAACGACGGCCAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACGATTAGAGTTTGATCCTGGCTCAGAACGAACGCTGGCGGCATGCCTAATACATGCAAGTCGAACGAGATCCTTCGGGGTCTAGTGGCGCACGGGTGCGTAACGCGTGGGAATCTGCCCTTGGGTTCGGAATAACGTTTGGAAACGAACGCTAATACCGGATGATGACGAAAGTCCAAAGATTTATCGCCCATGGATGAGCCCGCGTAGGATTAGCTAGTTGGTAAGGTAAAGGCTTACCAAGGCGACGATCCTTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATATTGGACAATGGGGGCAACCCTGATCCAGCAATGCCACGTGAGTGATGAAGGCCTTAGGGTTGTAAAGCTCTTTTACCCGGGATGATAATGACAGTACCGGGAGAATAAGCCCCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGGGCTAGCGTTGTTCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGTAGGCGGCGATTTAAGTCAGGGGTGAAAGCCGAGTGCTCAACACTGGAACTGCCTTTGAGACTGGATTGCTTGAATCACGGAGAGGTGGGTGGAATTCCGAGTGTAGAGGTGAAATTCGTAGATATTCGGAAGAACACCAGTGG