毛细管电泳法筛选微生物絮凝剂菌株条件探究.doc

毛细管电泳法筛选微生物絮凝剂菌株条件探究 　　【摘 要】 本文利用微生物絮凝剂电荷中和的机理，根据毛细管电泳的分析分离原理，摸索筛选出带正电荷较多的菌株的电泳条件，最适毛细管电泳环境为：毛细管电泳缓冲液pH为7，样品添加物为0.2%DMSO，仅在进口端添加内标物铬酸钾，清洗条件为1%DMSO洗5min缓冲液洗10min。 【关键词】 毛细管电泳 电荷 微生物絮凝剂 毛细管电泳[1]作为一种重要的分离分析技术，除了用于大分子离子的荷电分离，还用于细菌之间的分离。由于细菌表面覆盖许多肽聚糖、多糖类、脂类[2]等物质，且这些物质在电泳缓冲液中可以解离和吸附形成双电层，所以，在毛细管电泳中可将细菌当作“离子”看待。在一定的生理条件下，电泳缓冲液种类、pH值等参数对细菌表面基团的解离状态有很大影响。因此，要想用毛细管电泳筛选出带正电荷较多的微生物絮凝剂[3-4]菌株，就要研究毛细管的最佳电泳条件。 1 实验部分 1.1 实验材料 使用菌株来自本实验室及各种土壤中。 1.2 实验方法 （1）毛细管电泳最适缓冲液pH的确定。分别配置pH5、pH7和pH9的35mmol硼砂缓冲液，调试毛细管电泳仪的进样时间15秒，电压10kv，将配置好的缓冲液加入进样缓冲液瓶中，放于HOME位，将样品1号菌体1000转离心5min后，加入0.1%NaCl重溶后，取0.3ml放入样品槽，开始清洗，直到与基线几乎平行，没有杂质峰时，开始测样。 （2）样品添加物对毛细管电泳筛选菌株的影响。分别配置0.2% NaCl、0.2%蔗糖和0.2%DMSO溶液，调试毛细管电泳仪的进样时间15秒，电压10kv，使用体积比为1：1的pH7缓冲液+9%蔗糖，加入进样缓冲液瓶中，放于HOME位，样品为1号菌体1000转离心5min后，分别添加添加0.2%NaCl、0.2%蔗糖和0.2%DMSO溶液重溶后放入样品槽，开始清洗，直到与基线几乎平行，没有杂质峰时，开始测样。 （3）毛细管电泳内标物的确定。配置0.1%铬酸钾溶液，调试毛细管电泳仪的进样时间15秒，电压15kv，使用体积比为1：1的基础缓冲液（pH7缓冲液+9%蔗糖），然后取0.1%铬酸钾溶液200μL混合均匀后加入进样缓冲液瓶中，放于HOME位，其中0.1%铬酸钾溶液在两端均添加。样品为1号菌体1000转离心5min后，加入0.2%DMSO溶液重溶后放入样品槽，开始清洗，直到与基线几乎平行，没有杂质峰时，开始测样。 （4）DMSO添加量对毛细管电泳筛选菌株的影响。分别配置0.2%、0.5%和1%DMSO溶液，调试毛细管电泳仪的进样时间15秒，电压15kv，使用体积比为1：1的pH7缓冲液+9%蔗糖，放于HOME位，将样品1号菌体1000转离心5min后，分别加入0.2%、0.5%和1%DMSO重溶后，取2ml放入样品槽，开始清洗，直到与基线几乎平行，没有杂质峰时，开始测样。 （5）清洗条件的确定。分别配置1%DMSO与缓冲液和3%DMSO与缓冲液轮流清洗管壁，调试毛细管电泳仪的进样时间15秒，电压15kv，清洗时间确定，清洗时间到则开始测样。 2 结果分析 2.1 毛细管电泳最适缓冲液pH的确定 分析可知，pH7时，菌体所带正负电荷接近，缓冲液中没有多余的正电荷影响样品的流动，所以在此条件下样品的出峰速度主要取决于样品本身即菌株的带电量。故选择pH7缓冲液为筛选菌株带电量的最适pH，如果菌株出峰时间早，则说明带正电荷相对较多，如果出峰时间较晚，则说明带正电荷相对较少。 2.2 样品添加物对毛细管电泳筛选菌株的影响 分析可知，只有添加0.2%DMSO时，几乎没有杂峰，样品峰清晰而稳定，一方面可以说明DMSO有净化管壁减少杂峰的作用，另一方面还说明它有很强的集聚作用，使菌体在毛细管内凝聚在一起，从而达到加强峰高并使稳定的作用。 2.3 毛细管电泳内标物的确定 为校正出峰时间波动，在缓冲液中添加内标物，结果发现在2min处总出现一个向下的台阶。由此分析，在进口端添加K2CrO3时，内标时间与样品出峰时间呈负相关，可判断CrO32-在毛细管内是从负极端流向正极端，与样品在毛细管中的流动方向相反，即与毛细管的主要驱动力电渗流的方向相反，当电渗流[5]（毛细管中表现为电流）速度快时，就阻碍了铬酸离子在毛细管中的速度，台阶时间就会推迟，但菌体出峰时间与电渗流速度是一致的，此时，菌体出峰时间就会较早；相反，如果台阶时间提前，菌体的出峰时间就会推迟。因此，可以作为菌株出峰时间的内标。 2.4 DMSO添加量对毛细管电泳筛选菌株的影响 DMSO的添加可避免菌体样品出峰的不集中状态，然而DMSO是有紫外吸收的，如果加量过大，有