蛋白质类物质分析测定.ppt

第五章、蛋白质类化合物 的测定 第一节、粗蛋白质的测定  蛋白质主要化学元素为C、H、O、N，碳水化合物、脂肪中只含有C 、H、O，不含氮，所以含氮是蛋白质区别于其他有机化合物的主要标志。不同的蛋白质中氨基酸的构成比例及方式不同，故不同的蛋白质含氮量不同。一般蛋白质含氮虽为16％，即1份氮素相当于6．25份蛋白质。此数值称为蛋白质系数，各种蛋白质的含氮量稍有不同，所以换算系数也有差别，如玉米为6．25，小麦粉为5．70，大麦等5．83，大豆为5.71。一般蛋白质的平均含氮量以16％计算。 测定蛋白质的方法可分为两大类：一类是利用蛋白质的共性，即含氮量、肽键和折射率等测定蛋白质含量，另一类是利用蛋白质中特定氨基酸残基、酸性和碱性基团以及芳香基团等测定蛋白质含量。蛋白质测定最常用的方法是凯氏定氮法。此外，双缩脲分光比色法、染料结合比色法、酚试剂法等也常用于蛋白质含量测定．出于方法简便快速，多用于生产单位质量控制分析。近年来，采用红外检测仪对蛋白质进行快速定量分析。 蛋白质可以被酶、酸或碱水解，最终产物为氨基酸。在常规检验中多测定样品中的氨基酸总量，通常采用酸碱滴定法来完成。近年世界上已出现了多种氨基酸分析仪、近红外反射分析仪，可以快速、准确地测出各种氨基酸含量。 测定有机总氮的主要方法是凯氏定氮法，它具有测定准确和操作简单的优点，常用作蛋白质测定的标准方法。凯氏定氮法可用于所有动物性、植物性原料蛋白质含量测定，但因样品中常含有核酸、生物碱、含氮类脂、以及含氮色素等作蛋白质的含氮化合物，故通常将测定结果称为粗蛋白质含量。 凯氏定氮法于1833年提出，经长期改进，迄今已演变成常量法、微量法、改良凯氏定氮法、自动定氮仪法、半微量法等多种方法。 一、凯氏定氮 （一）原理 将样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而样品中的有机氮转化为氨，并与硫酸结合成硫酸铵，此过程称为消化。加碱将消化液碱化，使氨游离出来，再通过水蒸气蒸馏，使氨蒸出，用硼酸吸收形成硼酸铵，再以标准盐酸或硫酸溶液滴定，根据标准酸消耗量可计算出蛋白质的含量。 1．消化 试样与浓硫酸和催化剂一同加热，使有机质破坏，蛋白质分解，其个碳和氢完全被硫酸的分解物氧化为二氧化碳和水逸去，而氨则与硫酸结合生成硫酸铵，留在溶液中： 浓硫酸具有脱水性，使有机物脱水并炭化为碳、氢、氮。 浓硫酸又有氧化性，使炭化后的碳氧化为二氧化碳，硫酸则被还原成二氧化硫： 二氧化硫使氮还原为氨，本身则被氧化为三氧化硫，氨随之与硫酸作用生成硫酸铵留在酸性溶液中： 在消化反应中，为了加速蛋白质的分解，缩短消化时间，常加入下列催化剂： 硫酸钾：加入硫酸钾目的是为了提高溶液的沸点，加快有机物的分解。硫酸钾与硫酸作用生成硫酸氢钾可提高反应温度，一般纯硫酸的沸点在340℃左右，而添加硫酸钾后，可使温度提高至400℃以上，而且随着消化过程中硫酸不断地被分解，水分不断进出而使硫酸氢钾的浓度逐渐增大，放沸点不断升高，其反应式如下：  硫酸钾的加入量也不能太大，否则消化体系温度过高会引起已生成的铵盐发生热分解析出氨而造成损失，除硫酸钾外，也可以加人硫酸钠、氯化钾等盐类来提高沸点效果不如硫酸钾。 硫酸铜：硫酸铜起催化剂的作用。凯氏定氮法中可用的催化剂种类很多，除硫酸铜外，还有氧化汞、汞、硒粉等，但考虑到效果、价格及环境污染等多种因素，应用最广泛的是硫酸铜、使用时常加入少量过氧化氢、次氯酸钾等作为氧化剂以加速有机物的氧化分解，硫酸铜的作用机理如下所示； 反应不断进行，待有机物全部被消化完后，不再有硫酸亚铜(褐色)生成，溶液呈现清澈的二价铜的篮绿色。故硫酸铜除起催化剂的作用外，还可指示消化终点的到达，以及下一步蒸馏时作为碱性反应的指示剂。 2．蒸馏 硫酸铵在碱件条件下释放出氨，通过加热蒸馏，氨随水蒸汽蒸出： (NH4)2S04十2NaOH——Na2S04十2H2O十2NH3 ? 3．吸收和滴定 馏出来的氨，被硼酸溶液吸收，然后用盐酸标准溶液滴定生成的硼酸铵，属于盐类的滴定。硼酸为极微弱的酸，在滴定中并不影响所用指示剂的变色反应。根据盐酸溶液消耗的体积，计算总氮合量，再乘以蛋白质系数，即为粗蛋白质的含量。 （二）微量法 试样中往往含有一定的杂质或其他干扰分析测定的成分，所以在分析测定前，要对样品进行处理即根据被测物质和干扰物质间性质上的差异，使用不同的分离方法，把被测物质同干忧物质分离开来，或者使干扰物质分解除去，而能将被测物质浓缩，从而使分析测定得到理想的结果。 1．试剂 (1)3％硼酸溶液。 (2)0．05N或0