一株鸡大肠埃希氏菌裂解性噬菌体的鉴定.docVIP

一株鸡大肠埃希氏菌裂解性噬菌体的鉴定 杨慧敏 刘佳瑞 王宗 【摘要】以实验室保存的一株大肠杆菌噬菌（宋EcpP3）体测定其效价、噬菌体斑大小、最佳感染复数、噬菌谱、热稳定性及PH稳定性。结果显示噬菌体的效价为1.08×10^9，PH应用范围在5.5~8.5之间。 【关键词】生物学特性 禽大肠杆菌病(Avian colibacillosis)是由大肠杆菌(Escherichia．eoli)某些致病性菌株引起的局部或全身的感染性疾病，这类疾病在鸡群中一般发病率为I1％～69％，死亡率3．8％～72．9％。并且患鸡对鸡沙门氏菌、新城疫、法氏囊病等易感性 增高，引起并发症或继发病，给鸡场造成巨大的经济损失。 长期以来禽大肠杆菌病主要采用抗生素治疗，但由于长期大剂量用药，特别是未做药敏试验的盲目用药(如滥用抗生素、磺胺等)致使耐药菌 株越来越多，耐药谱越来越广，产生耐药性的能力越来越强，导致药物治疗越来越难，细菌的耐药性已经成为世界的难题。本项目试图通过寻找出对鸡大肠杆菌敏感的噬菌体，从而使“噬菌体”成为防治鸡大肠杆菌病的新途径。 目前对噬菌体用于禽类细菌感染治疗方面的研究较少。在20世纪80年代初才有人将噬菌体用于预防动物的大肠杆菌病。本研究对实验室已存的一株噬菌体进行生物学特性分析。 1、材料与方法 1.1材料 普通LB培养基 1.2方法 1.2.1滴度测定　以LB培养基为稀释液，将纯化后的噬菌体作连续8倍稀释。 分别取100ml稀释后的各个梯度噬菌体与100ml 对应宿主菌菌悬液充分作用后，采用双层平板法进行培养，观察结果。上述每个稀释度分别做三个平行重复。计数时，选取噬菌斑数在30~300之间的平板，采用平均数计算滴度。 1.2.2测定噬菌斑大小　以LB培养基为稀释液，将纯化后的噬菌体作连续8倍稀释。 分别取100ml稀释后的各个梯度噬菌体与100ml 对应宿主菌菌悬液充分作用后，采用双层平板法进行培养，8小时后测定用游标卡尺测定噬菌斑大小。 1.2.3最佳感染复数测定 　感染复数是指感染发生之前，噬菌体与宿主菌数量的比值。最佳感染复数（MOI）表示子代最高产出率。取噬菌体对应的对数期菌悬液，菌液与噬菌体比例分别为1：1、1：0.1、1：0.001、1：0.0001，加入液体培养基调整每管总体积相同，37℃，150 r/min 培养 3.5 h，10 000 r/min 离心 10 min，取上清采用双层琼脂平板法测其效价，各点均作双份培养求其平均值，以产生最高噬菌体效价的 MOI 为最佳感染复数。 1.2.4 噬菌谱的测定　以实验室保存的25株鸡致病性大肠杆菌为指示菌，测定纯化的噬菌体液对菌株的裂解能力。 1.2.5热稳定性的测定 将噬菌体原液稀释至107CFU/mL，分别置于40℃、45℃的恒温水浴中，每间隔10min直到(1h)用双层琼脂法测定存活的噬菌体的数目，做三个平行重复。 1.2.6PH稳定性的测定 分别取不同值的液体培养基37℃水浴,待温度平衡后加入噬菌体液，经1h处理后,再用双层琼脂法计数，做三个平行重复。 结果 2.1效价×10^9 2.2噬菌斑大小×10^7 6.8×10^8 9.1×10^8 9.3×10^8 9.2×10^7 2.4噬菌谱测定： 噬菌谱 菌种 宋耀忠1 宋耀忠2 麻脾1 宋扣2 农科院3 裂解能力 2.7×10^6 6.72×10^7 无 无 无 玛郡5 红旗1 红旗2 肉鸡宋2 无 无 无 无 2.5热稳定性测定： 热稳定性 10min 20min 30min 40min 50min 60min 40℃ 6.85×10^7 6.4×10^7 6.3×10^7 4.6×10^7 4×10^7 45℃ 6.5×10^7 6.35×10^7 6.3×10^7 6.1×10^7 5.8×10^7 4.65×10^7 2.6PH稳定性测定： PH稳定性 PH=5.5 PH=7.5 PH=8.5 6.73×10^9 8.8×10^9 8.1×10^9 讨论 大肠杆菌病对养禽业的危害很大，而用噬菌体进行治疗可以适当的解决问题，而且对鸡本身的影响较小。用噬菌体治疗与用抗生素治疗相比有很多优势，噬菌体的优势：一是因噬菌体的特性，噬菌体可以随宿主菌的增殖而增殖，并在细菌感染的整个过程中发挥作用，与抗生素随时间的推移而逐渐降低疗效不同。二是在耐药性方面，由于噬菌体具有对特定的菌型的高度特异性，噬菌体能靶向到达细菌表面受体，从而弱化耐药突变，较少发生耐药性，并且噬菌体可以单独使用，也可以与其它抗生素联合使用以减少耐药性问题。第三，从应用方面来看，噬菌体的副作用小，不会影响禽大肠中的微生态环境，长期使用抗生素往往会造成大肠中的微生态环境紊乱，如果患者对抗生素敏感，噬