烟草合子时期特异表达基因的克隆与分析-江苏农业科学.pdfVIP

江苏农业科学　２０１６年第４４卷第５期 — ６５— 罗　岸．烟草合子时期特异表达基因的克隆与分析［Ｊ］．江苏农业科学，２０１６，４４（５）：６５－６８． ｄｏｉ：１０．１５８８９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００２－１３０２．２０１６．０５．０１７ 烟草合子时期特异表达基因的克隆与分析 罗　岸 （长江大学生命科学学院，湖北荆州４３４０２３） 　　摘要：在烟草合子中克隆到１种新型的未知功能基因ＮｔＺＥ５８３，编码包含有９１个氨基酸残基的多肽链。生物信 息学分析显示：该蛋白的Ｎ端含有１段疏水性信号肽，但在其他物种中没有发现同类蛋白。ＮｔＺＥ５８３－绿色荧光蛋白 （ＮｔＺＥ５８３－ＧＦＰ）融合蛋白亚细胞定位显示，该蛋白可能存在于液泡中。利用染色体步移技术获得该基因５′端上游３ ８６６ｂｐ的侧翼序列（启动子和５′ＵＴＲ），经检测发现，具有较强的启动子活性。研究结果为进一步研究该基因在烟草早 期胚胎发生中的功能奠定了基础。 　　关键词：烟草；合子；液泡；基因克隆；信号肽 　　中图分类号：Ｓ５７２．０１；Ｑ７８５　　文献标志码：Ａ　　文章编号：１００２－１３０２（２０１６）０５－００６５－０４ 　　被子植物的受精过程被称为双受精，即来自同一花粉的 因ＮｔＺＥ５８３进行克隆和染色体步移，获得了其完整ＣＤＳ序列 ２个精子同时进入胚囊，１个与卵细胞结合形成二倍体的合 和有活性的５′侧翼调控序列，为进一步利用基因敲除和过表 子，另２个与中央细胞结合形成三倍体的胚乳母细胞。受精 达技术来研究其在烟草早期胚胎发育中的作用打下基础。 ［１］ 完成后，胚胎逐渐形成基本的形态和生理结构 ，而胚乳则 ［２－３］ １　材料与方法 在此过程中扮演支持者的角色 。 对于受精和早期胚胎发生过程的分子机制在动物中研究 １．１　试验材料 得比较深入，但是在植物中由于技术手段的限制导致对这方 １．１．１　菌株与质粒　绿色荧光蛋白（ＧＦＰ）融合蛋白表达载 面的认识一直有许多空白。因为植物的受精和胚胎发生过程 体，ＧＦＰ核定位表达载体在ｐＡＲＴ２７载体上改造而成，由武汉 都存在于深埋在植物孢子体内的胚囊中，所以很难对整个过 大学彭雄波副教授提供。大肠杆菌ＤＨ５ 感受态为笔者所在 α 程直接进行观察并了解背后的分子机制。随着现代生物学技 实验室自制。 术的发展，目前已能获得玉米、拟南芥、大米、大麦等一些植物 １．１．２　植物材料　试验材料为野生型烟草（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａ 的配子、合子和早期胚胎；此外，这些植物中与生殖发育息息 ｃｕｍｖａｒ．ＳＲ１），种植于长江大学生命科学学院所属温室内， ［４－７］ 相关的细胞ｃＤＮＡ文库、转录谱等也已陆续获得 。这些 室温２５℃，光照时间１６ｈ。 进展对于研究植物的受精和胚胎发生过程起到了推动作用。 １．１．３　主要试剂　普通ＤＮＡ片段回收试剂盒、琼脂糖凝胶 为了探索受精和早期胚胎发生的分子机制，特别是早期 回收试剂盒、质粒小提试剂盒（天根生化科技有限公司）； 胚胎发生中的表观调控机制、合子不等分裂、细胞间通信等重 ＤＮｅａｓｙＰｌａｎｔＭｉｎｉＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ公司）；ＵｎｉｖｅｒｓａｌＧｅｎｏｍｅ 大问题，笔者所在实验室用前期建立的胚胎分离技术［８－９］和 ＷａｌｋｅｒＫｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ公司