以胰岛新生相关蛋白启动子为靶点的基因表达上调剂筛选模型的建立.pdfVIP

中国医药生物技术 2014 年 10 月第 9 卷第 5 期 Chin Med Biotechnol, October 2014, Vol. 9, No. 5 335 DOI:10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2014.05.003 ·论著· 以胰岛新生相关蛋白启动子为靶点的 基因表达上调剂筛选模型的建立 与初步应用 张许萌，王林林，任浩，何琪杨，陈汝贤，解云英 【摘要】 选物[5]，在胰岛新生过程中发挥着重要作用。已有 目的 建立以胰岛新生相关蛋白启动子为靶点的高通量筛 动物实验表明，INGAP 能够促进 β 细胞的增殖， 选模型，用于胰岛新生相关蛋白基因表达上调剂的筛选。 逆转 I 型糖尿病大鼠的高血糖症状[5-6] ；另外，相 方法 以叙利亚金黄地鼠基因组 DNA 为模板扩增胰岛新 关 II 期临床研究证明，INGAP 能够促进内源性胰 生相关蛋白核心启动子序列，克隆至 pGL4.17 质粒载体构 岛素分泌，改善血糖控制[7] 。因此，INGAP 是一个 建重组质粒。采用脂质体介导的方法将重组质粒和内参质粒 潜在的安全有效的糖尿病治疗新靶点。 pRL-TK 共转染金黄地鼠胰岛 β 细胞 HIT-T15 ，双荧光素 本研究以 INGAP 基因启动子为靶点，建立以 酶报告基因系统检测荧光素酶的表达活性。对瞬时转染条件 细胞为基础的、能够检测其转录活性的筛选模型， 进行优化，以豆蔻酸-佛波醇-乙酸酯作为阳性对照来评价模 以期发现能够特异性上调 INGAP 表达的活性化 型的有效性，并利用该细胞模型对本研究所的化合物库进行 合物，为糖尿病的治疗提供新的候选药物。 筛选。 结果 构建了重组荧光素酶报告基因质粒 pGL4.17-INGAP ， 1 材料与方法 并成功转染 HIT-T15 细胞株。对模型进行优化后，应用阳 1.1 材料 性对照对其进行评价，Z 因子为 0.57 ，适用于进行高通量 1.1.1 细胞株和质粒 金黄地鼠胰岛 β 细胞株 筛选。用该模型筛选了本所化合物库，其中白藜芦醇显示出 HIT-T15 （ATCC CRL-1777 ）购自中国科学院昆明 较好的上调作用，EC50 为 1.6 μg/ml 。 细胞库；E.coli DH5α 感受态细胞购自宝生物工程 （大连）有限公司；pGM-T 购自天根生化科技（北 结论 成功建立了以胰岛新生相关蛋白启动子为靶点的基 京）有限公司；pGL4.17 （luc2/Neo ）和 pRL-TK 由 因表达上调剂筛选模型。 本所生物工程室惠赠。 【关键词】 转录启动子； 药物评价，临床前； 胰岛 1.1.2 工具酶和主要试剂 Ex Taq 酶、T4 DNA 新生相关蛋白 连接酶等购自宝生物工程（大连）有限公司；RPMI 中国医药生物技术, 2014, 9(5):335-340 1640 培养基为美国 Thermo 产品；胎牛血清为美 国 Gibco 公司产品；血液/细胞/组织基因组 DNA 糖尿病是以高血糖为主要特征的代谢性疾病， 并伴有严重的并发症，降低了患者的生活质量[1] ， 提取试剂盒、质粒小提试剂盒（离心柱型）、普通 琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒等购