免疫沉淀法纯化线粒体的研究-四川动物.pdfVIP

四川动物 年 第 卷 第 期 免疫沉淀法纯化线粒体的研究 叶灵 姜长安 四川大学华西医院生物治疗国家重点实验室成都 摘要 传统的线粒体分离技术如差速离心和密度梯度离心不能有效应用于小规模高纯度的线粒体制备 为 了提高线粒体纯化的速度和质量我们尝试运用免疫沉淀法制备线粒体 通过用融合蛋白来标记线粒 体外膜然后用单克隆抗体和 珠子做免疫沉淀从培养的细胞中分离出高纯度的线粒体 这 一简便高效的方法将有助于线粒体的生化研究 关键词 线粒体纯化 稳定表达 外膜蛋白 免疫沉淀 中图分类号 文献标识码 文章编号 线粒体不仅是细胞的能量代谢中心也是细胞 在本研究中我们尝试用免疫沉淀的方法从培 养的细胞中提取线粒体 先利用线粒体外膜蛋白 内许多重要生理过程如细胞质 平衡细胞凋 亡干扰素反应等不可或缺的调节位点 的定位序列将和标签转运到线粒 近年来大量的数据表明线粒体 体外膜上然后用单克隆抗体和 功能失调与许多疾病的发生发展直接相关尤其是 珠子将标记的线粒体从细胞匀浆中分离出来从 退行性神经疾病因此线粒体的调节功能和作用机 而获得高纯度的线粒体以用于下游的生化分析 制已越来越成为当前生物医学研究的一个热点 材料与方法 相对于遗传学和细胞生物学方面的研究线粒 体的生化研究目前还比较滞后 其中的主要技术瓶 主要材料与试剂 颈是难以高效率高纯度地纯化线粒体 传统的线 琼脂糖凝胶回收试剂盒质粒小量提取试剂盒 粒体纯化方法是通过破坏细胞膜先以较低的离心 均购自 各种限制性内切酶购自 力沉淀去除细胞核和细胞碎片再以较高的离心力 培养基购自胎 沉淀线粒体 这种粗提的线粒体一般纯度较低含 牛血清购自蛋白酶抑制剂 和 标记的 二抗购自 有不少细胞质蛋白甚至其他细胞器 用密度梯度离 单克隆抗体购自公司 心作进一步纯化可以再提高纯度但往往产率很低 珠子购自细胞购 因此建立一种高效而廉 自其他生化试剂均为国产分析纯 价的线粒体纯化方法对线粒体的生化研究将有重要 质粒购自 意义 收稿日期 接受日期 基金项目国家自然科学基金 作者简介叶灵 女硕士研究生研究方向神经分子生物学 通讯作者 四川动物 年 第 卷 第 期 线粒体标签蛋白表达质粒的构建 样品用 的分离胶分离后转移至 膜 含 是线粒体外膜蛋白 已有的数据表明 脱脂奶粉的封闭 抗或单抗 蛋白端的 个氨基酸是负责将它转运上 孵育过夜洗膜二抗孵育后用 线粒体外膜的信号序列 用