霍乱弧菌环境分离株基于多位点探针熔解曲线的-中华预防医学杂志.pdfVIP

·检验技术 ·表4 图2参7 占6面 发排稿 霍乱弧菌环境分离株基于多位点探针熔解曲线的快速分型方法研究 黄仕杰 刘赞赞 温慧欣 李莉 李庆阁 黄建炜 DOI：10.3720/cma.j.i n.0253-9624.2015.02. 基金项目：福建省科技计划重点项目（2008Y0301） 作者单位：361021 厦门市疾病预防控制中心检验科（黄仕杰、温慧欣、李莉、黄建炜）； 厦门大学生命科学学院（刘赞赞、李庆阁） 通信作者：黄建炜，Email：fjxmhjw@163.com 【摘要】目的 研究基于探针熔解曲线分析的多位点熔解分型技术 （McMLMT）的霍乱弧 菌快速分型方法。 方法 选取厦门市CDC于 1998—2010年霍乱病原监测中从各种水体和 水产品等监测样品中分离的霍乱弧菌分离株 （ctx-）作为试验菌株，共 108株。筛选霍乱弧 菌7个管家基因，针对每个基因设计特异引物和覆盖多态性位点的4条荧光探针，建立各基 因的双管双色探针熔解曲线分析 （PCR-MCA）检测体系，检测108株试验菌株，获取28个熔 点值 （T 值），转化为等位基因编码并确定型别。同时对7个管家基因的多态性区域序列参m 照多位点序列分型方法（MLST法）进行分型。两种方法的分型数据以BioNumeric 软件进 行聚类分析比较，并与其中部分菌株PFGE分型数据比较，评估McMLMT 的分辨能力和可靠性。 结果 构建并优化了霍乱弧菌McMLMT分型体系。应用McMLMT分型体系检测霍乱弧菌，108 株霍乱弧菌的28个T 值按管家基因分组并依顺序编码后，可分为 18型（D=0.7233）；同m 时参照MLST方法直接以7个基因的多态性区域序列进行分型，分型结果与McMLMT一致；其 中46株PFGE型别不同的菌株，McMLMT法可分为13 个熔解类型 （D=0.6145），PFGE法可 分为A～K 的11 群(相似度85%，D=0.8589)。结论 采用McMLMT分型方法可以对批量菌株 进行快速分型，分辨力与MLST法相同，与PFGE法在相似度85%分群的分辨力相似。 [关键词]弧菌，霍乱；细菌分型技术；聚类分析 Development of a rapid molecular typing method for Vibrio cholerae using MeltingCurve-basedMultilocusMeltTyping HuangShijie,LiuZanzan WenHuixin* , , , , * Lili Li Qingge HuangJianwei. Department ofMicrobiology,Xiamen Centrefor Disease Control andPrevention,Xiamen 361021,China Correspondingauthor:HuangJianwei,Email:fjxmhjw@163.com [Abstact] ObjectTodevelopahigh-throughputrapidmethod for V.choleraemolecular typingbased onMelting Curve-basedMultilocusMelt Typing (McMLMT). Methods Seven housekeeping genes of V.cholerae were screened out and for each gene the specific primers were then designed forcorrespondentgenes aswell as4probes coveringpolymorphism loci of sequences. After optimizing all parameters a method of melting-curve analysis following asymmetric PCR was established with dual-fluorescent-reporter in two reaction tubes for each gene.Asetof28Tm-valueswasobtainedforeachstrainandthentranslatedintoasetofcodeof allelic genes， standing for the strain