基于噬菌体展示抗体的电化学发光免疫传感器检测相思子-分析化学.pdfVIP

第4 1 卷 分析化学 (FENXI HUAXUE)摇 研究简报 第9 期 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 2013 年9 月 Chinese Journal of Analytical Chemistry 1449 ~1453 DOI:10.3724/ SP.J.1096.2013.30084 基于噬菌体展示抗体的电化学发光免疫传感器检测 相思子毒素研究 * 刘 冰摇 童朝阳 摇 刘 威摇 郝兰群摇 穆晞惠摇 黄启斌 (防化研究院,国民核生化灾害防护国家重点实验室,北京 102205) 摘摇 要摇 以多克隆抗体包被磁性微球制备捕获探针,以表面负载大量三联吡啶钌标记物的噬菌体展示抗体 为发光探针有效放大信号,成功建立了相思子毒素电化学发光免疫传感检测方法。 利用本方法检测相思子毒 素,浓度在0.005 ~100 滋g/ L范围内与电化学发光强度呈良好的对数线性关系,拟合方程为lgY=0.701lgX+ 1.767(R=0.9964,N=7,p0.0001),检测限达0.005 滋g/ L(S/ N=3)。 与采用单克隆抗体制备标记探针相比, 检测灵敏度提高20倍,可用于相思子毒素的痕量检测。 关键词摇 噬菌体展示抗体;相思子毒素;电化学发光;免疫传感器 1摇 引摇 言 电化学发光(Electrochemiluminescence,ECL)免疫传感器检测蛋白类生物大分子多是以传感器表面 2+ 固定抗体为捕获探针,以发光标记物如联吡啶钌[Ru(bpy) ]标记抗体为发光探针,在靶标存在的情况 3 下,形成“捕获探针鄄靶标鄄发光探针冶复合物,在电极表面发生ECL反应,以此测定靶标浓度[1~5]。 抗体 活性以及标记物的量将直接影响检测的灵敏度。 对于传统抗体,分子表面可供标记的基团有限,而且多 位点标记也可能影响其结合活性,这限制了灵敏度的进一步提高。 噬菌体展示抗体是通过噬菌体展示技术获得的一种可溶性抗体片段或是表面展示有抗体片段的噬 [6] 菌体 ,对于后者,其表面除了展示的抗体片段外就是大量的衣壳蛋白。 以展示有单链抗体(Single chain variable fragments,scFv)的M13 噬菌体为例,M13为丝状,长约900 nm,宽约8 nm,衣壳约由2800 [7] 拷贝的5 kDa 的主要衣壳蛋白p峪组成 ,scFv融合表达在位于一端的约5拷贝的次要衣壳蛋白p芋中 [8] 的1个拷贝上。 若进行标记,会有更多的标记物连接在数量庞大的衣壳蛋白上 ,展示抗体仅仅是“躲 在冶一端的一个小角落里,从而被标记上较少的标记物,可最大限度避免多位点标记造成的活性降低或 消失。 因此,噬菌体展示抗体做标记探针能大大增加标记物数量,而又最小程度影响结合活性,从而起 到放大信号作用。 本研究以剧毒生物毒素相思子毒素(Abrin)为检测目标,以Abrin多克隆抗体(多抗)包被的磁微球 2+ 为捕获探针,以Ru(bpy) 标记的Abrin噬菌体展示抗体为发光探针,将磁性微球分离富集与噬菌体展 3 示抗体大量负载发光标记物放大ECL信号相结合,建立了一种检测Abrin 的新方法,有效放大了检测信 号,提高了检测灵敏度。 2摇 实验部分 2.1摇 仪