如何设计sybrgreen法荧光定量pcr引物-上海捷瑞生物.pdfVIP

上海捷瑞生物工程有限公司 如何设计SybrGreen 法荧光定量PCR 引物 荧光定量 PCR 是利用荧光定量 PCR 仪（如ABI 7500、stepone、ROChe LightCycler、Bio-Rad CFX96 等）通过实时追踪 PCR 每一步循环的荧光信号 值来达到对起始模板量的定量分析。一次成功的荧光定量 PCR 反应除了需要稳 定的仪器、优质的 Taq 酶、比较好的模板质量，更需要高质量的引物对。想要 得要高质量的引物对的前提是引物的设计必须要精益求精。下面我们以人IL6 基 因为例（以人IL6 基因mRNA 序列作为模板设计引物），给大家讲解如何进行高 质量的引物设计。 （1 ）利用 NCBI 数据库，查询基因的序列。登录 NCBI 官方主页： /。在栏目项中选择“Gene”，关键词输入“IL6 and homo”，具体如下所示，点击“Search”。 （2 ）结果如下，一般第一条基因即为所要查询的基因，这里需要注意“Aliases” 一栏，因为很多基因有很多别名，在查询时需要注意。明确基因后，直接点击 ，进入人IL6 基因的主页。 1 上海捷瑞生物工程有限公司 （3 ）进入人IL6 基因的主页后，往下拉动网页，看到如下界面。由于我们设计 引物的模板是mRNA ，所以我们要找到该基因的转录本信息。点击“reference sequence details”。 （4 ）得到如下界面，我们看到，人IL6 基因在 NCBI 里的记录是2 个转录本， 我们在设计引物时，除非需要检测某个特定的转录本，一般的做法是将该基因所 有的转录本序列进行比对分析，找到他们共有的序列区域，选择该共有区域作为 模板设计引物，这样设计的引物就能尽可能的扩增出该基因的所有mRNA 信息。 针对IL6 基因，我们分别点击“NM_000600.4”和“NM_001318095.1”打 开这两个转录本信息。 2 上海捷瑞生物工程有限公司 （5 ）我们看到，人IL6 基因的两个转录本序列大小不一样，分别为1197bp 和 1006bp。我们将这两条mRNA 序列复制到比对软件（如 BIOEDIT 等）中，运 用软件对这两条序列进行比对分析。 （6 ）比对结果如下，从比对结果看出，这两条序列前后均一致，只有转录本2 在141-331bp 处发生了缺失，我们选择共有区域331bp-1197bp 的序列作为 3 上海捷瑞生物工程有限公司 模板设计引物。 （7 ）将这段共有序列复制到引物设计软件中，引物设计的软件很多，比如 Primer premier6.0、Oligo7.37、在线Primer3、Beacon Designer、在线NCBI Primer-BLAST 等。不同的引物设计软件的工作原理大同小异，基本都具备引物 设计的基本原则 （后面列出），但是对引物Tm 值的计算结果不同的软件可能有 差异，这主要跟计算方法有关。捷瑞生物提供免费的引物设计服务，所使用的设 计软件是自主开发，并自主运行ePCR （电子PCR ），具备引物BLAST 功能，尽 量选择最优化的引物对。下面以在线 NCBI Primer-BLAST 为例 ，说明引物的设 计过程。 （8 ）打开在线 NCBI Primer-BLAST 主页： /tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=Bla stHome。将序列复制到制定的位置，如下图。在“PCR product size”选择 Min “80”；Max “250”（荧光定量PCR 产物的大小尽量不要很大，保证 PCR 扩增的效率）。在“Database”一栏选择mRNA 数据库（一般默认为 Refseq mRNA