定量pcr检测microrna表达的数据归一化新技术-生物化学与生物.pdfVIP

生物化学与生物物理进展 Progress in Biochemistry and Biop hys ics 201 1, 38(5): 473~481 定量PCR 检测microRNA 表达 的数据归一化新技术* 1)** 2)** 1) 1) 1) 1)*** 1)*** 金幼芳 徐根明 李 艳 孟 丽 姜永厚 郭江峰 丁先锋 1) 2) ( 江理工大学生命科学学院，杭州310018； 杭州联川生物信息技术有限公司，杭州3100 18) 摘要 数据归一化技术对研究结果的分析具有重要的作用 在定量PCR 实验中，通常利用稳定表达的看家基因作为实验数 据归一化的内参，但最近的研究表明，这些看家基因的表达量在不同的生理病理过程中也表现出显著的变化，不适合作为数 据归一化处理的基准 针对这一问题，提出一种新的数据处理技术，利用单细胞归一化方法(percellome)，对定量PCR 检测 miRNA 表达的数据进行处理，显著提高了数据处理的准确性 以8 周龄/40 周龄小鼠脑为实验材料，选择 14 种microRNA 的表达情况 行了检测 在研究中，将3 种不同拷贝数的人工合成的RNA 片段(spike RNA)作为内参加入到样品中，用于 5 5 microRNA 表达检测的归一化基准 研究发现，未经处理的microRNA 单细胞拷贝数的变化范围为2.0 10 ～4.3 10 ，而经单 细胞归一处理，上述表达变化范围为2 到26 倍 该项研究还发现，看家基因U6 ncRNA 和5S rRNA 的表达水平存在显著的 变化，在以基因组DNA 为归一化基准时，其表达量变化为1.5 和4.8 倍，而在以RNA 水平为归一化基准时，其表达量变化 为5.8 和3.8 倍，表明这些基因不适合作为数据处理的基准 据此，为microRNA 的定量研究提供了一种新的、可靠的归一 化方案 关键词 单细胞归一化，定量PCR，spike RNA，miRNA 学科分类号 Q81，Q5 DOI: 10.3724/SP.J.1206.2010.00397 MicroRNA(miRNA) 是一类通过抑制翻译调控 为了对表达数据进行归一化处理，有的研究人 基因表达的非编码小RNA ，在动 物及真菌生长 员向被检测样品中加入一定量的外源RNA ，并以 [1-3] [4-5] 的时序性调节 、细胞增殖与凋亡 、肿瘤发生、 此为基准处理其他表达数据，得到了很好的技术效 [6-7] [16] 免疫调节和抗病毒 等方面发挥了重要的作用 果 如Holstege 等 采用加入spike RNA 的方法， 目前，miRNA 表达的定量检测通常通过实时定量 在基因组水平对循环通路的调节进行了研究，Hill [17] RT-PCR、基因表达克隆、RNA 杂交和微阵列芯片 等 也在杂交过程中加入一定比例的外源cRNA 作 [8] 杂交 等技术来实现，在定量RT-PCR 研究中，通 为标准品来均一化