农杆菌介导转化体系.doc

9311农杆菌介导转化体系（注：培养基“+”的为灭菌冷却到60℃后加）（一）诱导愈伤幼胚：取生长一致的植株，剥去主茎外层、叶鞘，将穗子剪成小段，在超净工作台上先用75％酒精浸5 min，用无菌水冲洗1次，再用次氯酸钠原液抽真空约10min至不冒气泡，再放于摇床振荡40min无菌水冲洗4～5次，然后在灭菌滤纸上小心挤出幼胚，放于诱导培养基（NB）上。每皿30粒，置于25~26℃下暗培养，以诱导愈伤组织。除不能萌发的幼胚外，愈伤诱导率到达98%。幼胚的萌发和污染受幼胚灭菌效果和接种操作的影响，所以请小心操作。（大概一周左右能见愈伤从盾片中长出，视愈伤和芽生长情况选择掐芽继代时间，如图1） 图1 适合掐芽作继代的9311幼胚愈伤 成熟种子：分别挑选健康籽粒剥去颖壳，置于37℃培养箱过夜。种子取出后放入灭菌的三角瓶中，先用体积分数为75％的乙醇表面灭菌5min，用无菌水冲洗1次，0.1％HgCl消毒12 min，用无菌水冲洗5次，再放入次氯酸钠原液消毒40 min，无菌水冲洗5次，于灭菌的滤纸上晾干，然后接种到诱导培养基上（9311为NB+ ABA 1mg/L），让胚的一半接触培养基。每皿20粒，置于25~26℃下暗培养，以诱导愈伤组织。（通过对四种基本培养基NBKNB、NB、MSTC、J0和NB+ ABA 0.5mg/L、NB+ ABA 1mg/L、NB+ NAA0.5mg/L、NB+ NAA1mg/L的研究表明，9311在NB+ ABA 1mg/L培养基中的诱导率是85%） 图2 适合掐芽的9311成熟种子 图3 掐了芽的9311成熟种子，继续放于诱导培养基中，这样状态的愈伤也可以去除谷粒和愈伤中的芽头直接转到继代J3中，但注意在去除谷粒和愈伤中的芽头时不要伤到愈伤也要去除干净 （二）继代培养 20后，挑选表面干爽、结构致密的愈伤组织，去除谷粒和愈伤中的芽头转到继代培养基上J3，这时候谷粒中营养已经被吸收而变软，继代培养1~2次，每次20。 图4 继代20天后的9311愈伤组织 （注意将愈伤继代的时候，不能用镊子将愈伤强行得分开，这样将导致褐化，需要做的是将愈伤自主分离的剥离，将褐化的愈伤除去，再将愈伤以原来相同的方向放在培养基上。） （三）农杆菌介导转基因 农杆菌准备：划LB板（EH105为LB+Kan50mg/L+CHL34mg/L），两天后挑单菌落划LB板（EH105为LB+Kan50mg/L+CHL34mg/L）全皿，过夜用将菌洗到50ml液体的共培养基（NBM+ As0.1mM）中，调OD600=0.5。 愈伤准备：从没继代或继代1~2次的愈伤组织中挑选表面干爽结构致密的，于灭菌的滤纸上风干至表面发白。 农杆菌介导转化：将愈伤转移到菌液中浸泡30min，每隔5min摇晃一次。菌水冲洗5次至液体不浑浊，用灭菌滤纸吸干水分，于灭菌的滤纸上风干至愈伤表面发白。将愈伤转移到共培养基（NBM + As 0.1mM）其上有用液体的共培养基浸湿的滤纸，25~26℃下暗培养3天。（第三天的时候可以在滤纸上看农杆菌的菌液，愈伤有些发油不过没有菌液） 筛选培养：3天后，将愈伤转入灭过菌的三角瓶中，用菌水冲洗5次至液体不浑浊，再用加有500mg/L头胞和400mg/L羧变青霉素的灭菌水浸泡30min，每隔5min摇晃一次。用灭菌滤纸吸干水分，于灭菌的滤纸上风干至愈伤表面发白转移到筛选培养基（J3+500mg/L头胞+400mg/L羧变青霉素+50mg/L潮霉素）中（注意一个培养皿不能接太多愈伤，大概控制在20个以内，防止没有抑制农杆菌的愈伤感染周围的愈伤，请每天都检查，及时将长农杆菌的愈伤用灭过菌的勺子挖除），25~26℃下暗培养，20天后将长出愈伤的转入新的筛选培养基中（因为不易分辨新长出的抗性愈伤和已经失去活性但没有变褐的愈伤，建议将所有可能的愈伤的移到新培养基上去） （四）分化培养 将筛选培养基中长出愈伤的转移到预分化培养基（Y+500mg/L头胞+400mg/L羧变青霉素）中，置于光培养~7天陆续有愈伤变绿，7天后统计愈伤变绿的百分率是53.46%。（最好将预分化培养基装在三角瓶中，因为在光照培养箱中培养皿水汽容易蒸腾到盖子上，三角瓶因为空间比较大形成的微环境适合预分化。） 图7 经过两次筛选产生的抗性愈伤转到预分化培养基 图8 经过7天预分化的愈伤状态 图9 经过7天预分化的状态比较好的愈伤 将预分化培养基中变绿的愈伤转到分化培养基（DL+500mg/L头胞+400mg/L羧变青霉素）中，置于光照培养，每20天更换一次培养基。 图10 转入分化培养基7天后愈伤生长情况 图11 转入分化培养基天后愈伤生长情况（五）生根培养 绿苗高约5~8cm时，转移到生根培养基（R）上，促进根的生长置于置于光照培养 图12 转入生根培养基7天后情