毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒-仪器信息网.pdfVIP

赤酵母多拷贝表达载体试剂盒 毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒 用于在含多拷贝基因的毕赤酵母菌中表达并分离重组蛋白 综述： 基本特征： 作为真核生物，毕赤酵母具有高等真核表达系统的许多优点：如蛋白加工、折叠、翻译 后修饰等。不仅如此，操作时与E.coli 及酿酒酵母同样简单。它比杆状病毒或哺乳动物组织 培养等其它真核表达系统更快捷、简单、廉价，且表达水平更高。同为酵母， 赤酵母具有 与酿酒酵母相似的分子及遗传操作优点，且它的外 蛋白表达水平是后者的十倍以至百倍。 这些使得毕赤酵母成为非常有用的蛋白表达系统。 与酿酒酵母相似技术： 许多技术可以通用： 互补转化 基因置换 基因破坏 另外，在酿酒酵母中应用的术语也可用于 赤酵母。 例如：HIS4 基因都编码组氨酸脱氢酶；两者中基因产物有交叉互补；酿酒酵母中的一些野 生型基因与 赤酵母中的突变基因相互补，如HIS4、LEU2 、ARG4 、TR 11、URA3 等基因 在 赤酵母中都有各自相互补的突变基因。 赤酵母是甲醇营养型酵母： 赤酵母是甲醇营养型酵母，可利用甲醇作为其唯一碳 。甲醇代谢的第一步是：醇氧 化酶利用氧分子将甲醇氧化为甲醛，还有过氧化氢。为避免过氧化氢的毒性，甲醛代谢主要 在一个特殊的细胞器－过氧化物酶体－里进行，使得有毒的副产物远离细胞其余组分。由于 醇氧化酶与O2 的结合率较 ，因而毕赤酵母代偿性地产生大量的酶。而调控产生醇过氧化 物酶的启动子也正是驱动外源基因在 赤酵母中表达的启动子。 两种醇氧化酶蛋白： 赤酵母中有两个基因编码醇氧化酶－AOX1 及 AOX2 。细胞中大多数的醇氧化酶是 AOX1 基因产物。甲醇可紧密调节、诱导 AOX1 基因的高水平表达，较典型的是占可溶性 蛋白的30%以上。AOX1 基因已被分离，含 AOX1 启动子的质粒可用来促进编码外 蛋白 的目的基因的表达。AOX2 基因与AOX1 基因有97%的同源性，但在甲醇中带AOX2 基因 的菌株比带AOX1 基因菌株慢得多，通过这种甲醇利用缓慢表型可分离Muts 菌株。 表达： AOX1 基因的表达在转录水平受调控。在甲醇中生长的细胞大约有 5%的polyA+ RNA 来自AOX1 基因。AOX1 基因调控分两步：抑制/去抑制机制加诱导机制。简单来说，在含 葡萄糖的培养基中，即使加入诱导物甲醇转录仍受抑制。为此，用甲醇进行优化诱导时，推 荐在甘油培养基中培养。注意即使在甘油中生长（去抑制）时，仍不足以使AOX1 基因达 到最 水平的表达，诱导物甲醇是AOX1 基因可辨表达水平所必需的。 AOX1 突变表型： 缺失 AOX1 基因，会丧失大部分的醇氧化酶活性，产生一种表型为 Muts 的突变株 （methanol utilization slow ），过去称为Mut，而Muts 可更精确地描述突变子的表型。结果 细胞代谢甲醇的能力下降，因而在甲醇培养基中生长缓慢。Mut+