微生物工程实验报告-刘华霞--09121033.docVIP

黑曲霉发酵生产a-淀粉酶 姓名：刘华霞 专业：09生物技术 学号（第三组） 摘要：本实验按照5%的接种量向10L机械搅拌式发酵罐接种，并测量了发酵期间的PH、生物量、酶活、残糖等参数随时间的变化，每6h取样检测一次，发酵三天后放罐（大约66h），并分析了参数变化的原因，从而得到黑曲霉生产a-淀粉酶各种物质和理化性质的变化。 关键词：黑曲霉 发酵 a-淀粉酶 pH 生物量 酶活 残糖含量 材料和方法： 1.1材料 菌种：黑曲霉 PDA培养基：土豆200g（去皮）煮沸30min过滤，加糖20g，加水定容至1L. 碘液：称取0.5gI2 ,5.0gKI，研磨溶解于少量蒸馏水，定容至100ml，褐色溶剂瓶内保存，避免阳光直射。 稀碘液：取原碘液1ml稀释100倍。此溶液现配现用。 0.5%淀粉液：称取干燥过的可溶性淀粉0.5g，加5ml缓冲液搅拌混合，再徐徐倾入70ml煮沸的缓冲液中，继续煮沸2min，冷切至室温，定容至100ml。此溶液需要当天配制。 缓冲液：Na2HPO4-NaH2PO4 （pH为6.0） pH 0.2mol/L Na2HPO4(ml) 0.2mol/L NaH2PO4(ml) 6.0 12.3 87.7 发酵培养基（g/l）：可溶性淀粉 400g；柠檬酸氢二氨 200g；KH2PO4 30g; CaCl2 1.0g;七水硫酸亚铁 0.1g；七水硫酸镁 0.1g；水 14L（12L蒸馏水加上后来在发酵罐中产生的冷凝水差不多是14L），pH调至5.00；消泡剂 4.0mL。· 蒽酮试剂：溶解0.2g蒽酮于浓硫酸1L中，当天配制使用。 1.2方法 1.21菌种制备 先配制好PDA培养基，分装好，向各瓶中接入黑曲霉，170rpm摇瓶，28°c培养。 1.22设备 发酵罐主要部件：罐身、搅拌器、挡板、冷却装置、空气分布装置、轴承、夹套、进料口、补料口、取样口等 水通道：分为冷却水和夹套水。冷却水可以使培养基降温，在发酵过程中，可以和夹套水一起控制发酵温度，夹套水为循环水，可以冷却也可以保温。 空气通道：空气经空压机压缩后，进入储气罐，经油水分离进入玻璃转子流量计，经过滤器后，进入罐底的空气分布器，尾气经罐顶过滤器后排出。 1.23空消 打开蒸汽发生器开关，等其压力上升到0.2Mpa,然后打开发酵罐上与之连通的相应的一些阀门，使蒸汽进入其中，当温度上升到121℃压强在0.1-0.15Mpa之间，稍微打开蒸汽出气口使体系温度和压强维持稳定，灭菌20min左右，结束后关闭蒸气管路，打开管道。 1.24实消 把配好的8L培养基由进料口加入，加4ml消泡剂，打开蒸汽管道以及相关阀门，121℃灭菌30 min，灭菌结束后，打开冷凝水的通道，关闭蒸汽管道，打开空气管道。 1.25接种 待罐内温度降至28℃时，在进样口附近用酒精棉球点火，接入上述培养好的菌种。 1.26发酵 发酵过程中要注意罐内的温度、压强等参数是否正常，每隔6h取样一次 2.实验方法 2.1 pH值得测定 将每次取得的发酵液用pH计进行测量，记录每次数据。 2.2生物量的测定 每隔六个小时物一次样，取10ml样品于离心管中，对所取的样品进行离心5000rpm，10min；所得上清液（即酶液）倒入一干净试管中保留，以便用于后面的酶活力和残糖含量的测定；弃去上清液后，向离心管中加入10ml水洗涤，混匀，再次离心，5000rpm，10min，离心之后弃上清，将得到的沉淀物刮至培养皿中放到180℃的烘箱中烘干，2-3小时后拿出来称量即为该批次的生物量（事先称好培养皿的重量）。 2.3酶活力的测定 设立对照组，空白组和实验组。 空白组：0.5ml 蒸馏水+5.0ml 稀碘液； 对照组：5.0ml0.5%淀粉→ 40℃预热10min→加入0.5mL缓冲液→反应5min →加入5.0mL 0.1mol/L硫酸终止反应→从反应体系中取出0.5ml的反应液加入5.0mL的稀碘液中 实验组：5.0ml0.5%淀粉→ 40℃预热10min→加入0.5mL稀释酶液→反应5min→加入5.0mL0.1mol/L硫酸终止反应→从反应体系中取出0.5ml的反应液加入5.0mL的稀碘液中 对上述所得的溶液进行可见光分光光度计法测量，记下数值并标明稀释倍数D。 2.4残糖的测定 本实验残糖的测定方法采取的是硫酸蒽酮法。设定的空白组是1.0mL的蒸馏水加入4.0mL的硫酸蒽酮溶液；实验组是1mL的稀释的残糖溶液加入4.0mL硫酸蒽酮溶液（三个平行组，并在冰水浴进行）。置沸水浴10min，再置于冰水浴中冷却10min，在620nm处测吸光光度值。 3.实验数据记录与分析 3.1.1发酵液pH值的变化 时间（h） 0 6 12 18 24 30 36