飞蝗海藻糖酶基因的分子特性及功能-中国农业科学.pdfVIP

中国农业科学 2016,49(22):4375-4386 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2016.22.010 飞蝗海藻糖酶基因的分子特性及功能 1 1,2 1 1 1 刘晓健 ，孙亚文 ，崔 淼 ，马恩波 ，张建珍 1 2 （山西大学应用生物学研究所，太原 030006 ； 山西大学生命科学学院，太原 030006 ） 摘要：【目的】海藻糖酶（trehalase）可专一性地将一分子海藻糖水解成为两分子葡萄糖，在昆虫能量代谢 和几丁质合成过程中发挥重要作用，因此，海藻糖酶已成为害虫控制的潜在靶标。本研究以重要农业害虫飞蝗 （ Locusta migratoria ）为材料，探讨海藻糖酶基因的分子特性及生理功能，为飞蝗的有效治理提供理论依据。 【方法】通过搜索飞蝗转录组和基因组数据库，获得4个海藻糖酶基因cDNA全长序列，运用blast、TMHMM和SignalP 等相关软件分析其序列特征；利用ClustalW进行海藻糖酶全长氨基酸序列比对，MEGA7构建海藻糖酶的系统进化 树；运用 reverse transcription-quantitative PCR（RT-qPCR）技术研究 4 个海藻糖酶基因在 5 龄若虫不同组 织及发育日龄的表达特性；体外合成4个基因的dsRNA 后，分别注射5龄第2天若虫，同时注射dsGFP 作为对照， 收集注射 dsRNA 48 h 后的整虫提取 RNA，反转录成 cDNA 后，采用 RT-qPCR 技术检测海藻糖酶基因以及几丁质合 成关键基因UDP-N-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶基因 LmUAP1 和几丁质合成酶1基因 LmCHS1 的表达量，并观察记录表型。 【结果】飞蝗 4 个海藻糖酶均含有海藻糖酶的 2 个功能保守区以及 1 个甘氨酸富集区，其中 1 个海藻糖酶具有跨 膜结构域，将其命名为LmTreM（GenBank登录号：KX371563），1个海藻糖酶具有类跨膜结构，将其命名为LmTreM-like （GenBank 登录号：KX371565），其余 2 个均为可溶性海藻糖酶，分别命名为 LmTreS1 和 LmTreS2（GenBank 登录 号：KX371564和FJ795020）；系统发育分析结果显示，LmTreM和LmTreM-like与膜结合型海藻糖酶聚为一支，而 LmTreS1 和 LmTreS2 与可溶性海藻糖酶聚为一支；对 4 个基因在 5 龄若虫不同组织部位和发育日龄表达量的分析 表明 LmTreM、LmTreS1 和 LmTreS2 具有组织特异表达特性，而 LmTreM-like 在所有组织部位中均表达，且 4 个海 藻糖酶基因呈现出不同的发育变化趋势；RNAi结果表明，分别注射飞蝗4个海藻糖酶基因dsRNA至 5 龄若虫后， 与对照组相比，各基因表达量均显著降低，且不存在基因间的交叉干扰，几丁质合成关键基因 LmUAP1 和 LmCHS1 的表达也无显著变化，注射各海藻糖酶基因dsRNA的 5 龄若虫均可成功蜕皮至成虫。【结论】飞蝗存在1个膜结合 型、1 个类膜结合型和 2 个可溶性海藻糖酶基因，这 4 个基因具有不同的组织和发育表达特性，任一基因的表达 沉默均不影响5龄飞蝗正常蜕皮至成虫。 关键词：飞蝗；海藻糖酶基因；表达特性；RT-qPCR; RNA干扰 Molecular Characteristics and Functional Analysis of Trehalase Genes in Locusta migratoria 1