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第一章 PCR 和 RT-PCR 基础 PCR 基础 聚合酶链式反应（PCR ）过程利用模板变性，引物退火和引物延长的多个循环来扩增DNA 序列。这是一个 指数增长的过程，因为上一轮的扩增产物又作为下一轮扩增的模板，使其成为检测核酸的一种非常灵敏的 技术。一般，经过 20-30 个循环得到的扩增产物就足够在溴化乙锭染色的凝胶上观察到。反应包括几个成 分（表 1）。模板可以为纯化的基因组或质粒DNA ；由RNA 转化得到的 cDNA ；或未经纯化的粗制生物样 品，如细菌克隆或噬菌斑。引物确定了扩增产物的序列和长度。最常用的热稳定聚合酶是Taq DNA 聚合酶。 这种酶适用于常规扩增，但是使用其他热稳定聚合酶会改善结果。扩增反应还包括缓冲液，三磷酸脱氧核 苷及镁离子。镁离子浓度影响酶的活性、引物退火、模板和 PCR 产物的熔点（Tm ），忠实性以及引物二聚 体的形成等。在随后的章节中将讨论这些成分、循环参数以及其他参与作用的因子相互间各种作用对于成 功 PCR 的影响 表 1. 反应成分 Component Final Concentration Template 10^4-10^6 copies of DNA template Primer 1 0.1-0.5µM Primer 2 0.1-0.5µM 10X Reaction buffer 1X Magnesium 1.0-3.0mM dNTP mix 200 mM each dNTP Thermostable DNA polymerase 1-4 units/100 ml reaction RT-PCR 基础 RT-PCR将以RNA为模板的cDNA合成同PCR结合在一起，提供了一种分析基因表达的快速灵敏的方法。RT-PCR 用于对表达信息进行检测或定量。另外，这项技术还可以用来检测基因表达差异或不必构建cDNA文库克隆 cDNA。RT-PCR 比其他包括 Northern 印迹、RNase 保护分析、原位杂交及 S1 核酸酶分析在内的 RNA 分析技 术，更灵敏，更易于操作。 RT-PCR的模板可以为总RNA或poly(A)+选择性RNA。逆转录反应可以使用逆转录酶，以随机引物、oligo(dT) 或基因特异性的引物（GSP）起始。RT-PCR可以一步法或两步法的形式进行。在两步法RT-PCR中，每一步 都在最佳条件下进行。cDNA的合成首先在逆转录缓冲液中进行，然后取出1/10的反应产物进行PCR。在一 步法RT-PCR中，逆转录和PCR在同时为逆转录和PCR优化的条件下，在一只管中顺次进行 这本指南阐述了成功 RT-PCR 和 PCR 的关键。高灵敏性（从小量样品中得到足量结果）和高特异性（选择 性地仅得到所需的产物）是成功 PCR 的标志。可以通过仔细的实验设计（如选择恰当的酶，设计最理想的 引物，使用不同的缓冲液和添加剂，确定循环参数及制备高质量的模板等）以获得最佳的 RT-PCR 和 PCR 。 第二章 增加 RT-PCR 灵敏度 分离高质量 RNA 成功的cDNA 合成来自高质量的RNA 。高质量的RNA 至少应保证全长并且不含逆转录酶的抑制剂，如EDTA 或 SDS。RNA 的质量决定了你能够转录到cDNA 上的序列信息量的最大值。一般的 RNA 纯化方法是使用 异硫氰酸胍／酸性酚的一步法。Trizol 试剂法（见下图）将一步法加以提高，可以从多种组织和细胞中提取 高质量的非降解 RNA 。Trizol 试剂法可以从最少 100 个细胞或 1mg 组织中提取 RNA 。 TRIzol®试剂步骤略图