SDS—PAGE凝胶电泳(细致分析).docxVIP

SDS电泳的基础原理和实验步骤名称：SDS（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis）十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳原理：此项技术的原理，是根据样品中蛋白质分子量大小的不同，使其在电泳胶中分离。不同的蛋白质在不同的pH值下表现出不同的电荷，同时蛋白质具有不同的大小和形状。为了使蛋白在电泳中的迁移率只与分子量有关，我们在上样前，通常会进行一些处理。上样缓冲液由Tris-HCl（pH6.8）?、甘油，10％SDS、β-巯基乙醇、0.1％溴酚蓝以及蒸馏水组成。其各自的作用如下述：SDS 即十二烷基硫酸钠，是一种阴离子表面活性剂，它可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级和三级结构； β-巯基乙醇是强还原剂，它可以断开半胱氨酸残基之间的二硫键。由于SDS和巯基乙醇的作用，蛋白质完全变性和解聚，解离成亚基或者单个肽链，因此测定结果只是亚基或者单个肽链的分子量。同时，SDS与蛋白质结合引起蛋白质的构象改变，形成长椭圆棒状，不同蛋白质短轴长度都一样，长轴随蛋白分子量不同而不同，这样就消除了性状的影响。另外，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白- SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。甘油用以增大样品液密度，使加样时样品溶液可以快速沉入样品凹槽底部。样品处理液中通常还加入溴酚蓝染料，用于监控整个电泳过程。SDS一般采用的是不连续缓冲系统，与连续缓冲系统相比，能够有较高的分辨率。浓缩胶的作用是有堆积作用，凝胶浓度较小，孔径较大，把较稀的样品加在浓缩胶上，经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带。样品液和浓缩胶中Tris-HCl均为pH6.8,上下槽缓冲液含Tris-甘氨酸（pH8.3）,分离胶含Tris-HCl(Ph8.8).电泳启动时，蛋白样品处于pH6.8 的上层，pH8.8 的分离胶层在下层，上槽为负极，下槽为正极。出现了 pH 不连续和胶孔径大小不连续：启动时Clˉ解离度大，Proˉ解离度居中，甘 aaCOOˉ解离度小，迁移顺序为（pH6.8）Clˉ Proˉ —COOˉ。在 Clˉ与 Proˉ之间和 Proˉ与—COOˉ之间都将出现低离子区，同时也出现高电势，高电势迫使 Proˉ向 Clˉ迁移，—COOˉ向 Proˉ迁移。如：一个 Clˉ领路，—COOˉ推动，蛋白在中间，这样就起到浓缩的作用了。在浓缩胶运动中，由于胶联度小，孔径大，Proˉ受阻小，因此不同的蛋白质就浓缩到分离胶之上成层，起浓缩效应，使全部蛋白质处于同一起跑线上。当蛋白质进入分离胶时，此时Proˉ，Clˉ，甘 aa 离子在 pH8.8 的溶液中，Clˉ完全电离而很快到达正极，甘 aa 电离度加大很快跃过蛋白质，而到达正极，只有蛋白质分子在分离胶中较为缓慢的移动,并被筛分而依各自的大小分离。SDS的有效分离范围取决于用于灌胶的聚丙烯酰胺的浓度和交联度。甲叉双丙烯酰胺和丙烯酰胺在过硫酸胺的作用下聚合形成胶。过硫酸铵（AP）在隔氧的状态下，最好现配现用，使用新鲜的。TEMED即四甲基乙二胺，为加速催化剂。交联后，形成SDS-蛋白复合物必须通过的小孔。这些小孔的孔径随甲叉双丙烯酰胺和丙烯酰胺的比率增加而变小，比率接近1:20时孔径达到最小。而其比率大多按1:29配制，试验表明他能分离大小相差只有3%的蛋白质。SDS聚丙烯酰胺凝胶的分离范围：3.试剂和器材：10％SDS10％过硫酸铵(新鲜配制) 1.5M Tris-HCl1.0M Tris-HCl30％丙稀酰胺TEMED原液考马斯亮蓝R-250染色液(考马斯亮蓝R250+甲醇+冰醋酸) 脱色液(甲醇+冰醋酸)蛋白质样品上样缓冲液(5mol／L Tris-HCl pH6.8+甘油+10％SDS+β-巯基乙醇+0.1％溴酚蓝+加水定容)电极缓冲液(pH8.3，SDS+Tris+Gly，加水定容)垂直板电泳槽电泳仪长滴管及微量加样器烧杯、量筒、培养皿枪头、注射器等操作步骤：（1）清洗玻璃板一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉 ?轻轻擦洗。两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。晾干的玻璃板使用前需用干净的擦镜布擦干净（2）灌胶与上样将两块玻璃板对齐后，且较为平整的一端向下放入制胶架夹中卡紧。然后垂直卡在架子上，下端与橡胶垫紧密贴合。可以加入适量蒸馏水验漏，看液面是否下降，不下降则表明不漏。按照配方表配制分离胶（蒸馏水、30%丙烯酰胺、1.5M TrisHCl、10%SDS、10%过硫酸铵以及TEMED），加入 TEMED 后立即搅拌摇匀即可灌胶。灌胶时，待胶面升到绿带中间线高度时即可。然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快，且胶面平整。灌胶时开始可快